ИЗУЧЕНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ PLEUROTUS OSTREATUS 1137 (ВКПМ, F-819) У ЖИВОТНЫХ НА МОДЕЛИ АТЕРОГЕННОЙ ДИЕТЫ
*В.П. Герасименя, *С.В. Захаров, **Т.И. Милевич, ** А.Д Наумов, **С.Н. Сушко
*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия; inbiofarm@mail.ru
**ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси», Гомель, Беларусь, irb@mail.gomel.by


Целью проведенных исследований являлось изучение гиполипидемической активности «Экстракта мицелия вешенки», составляющего фармакологическую субстанцию детоксикационного препарата, на модели атерогенной диеты.

Испытываемые вещества:
- ЭМВ (экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН») (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.10520.12.08. от 11.12.2008 г.), Удостоверение о государственной гигиенической регистрации в РБ 08-33-0.386427 от 03.06.2010 г.
- препарат сравнения «Зокор» (10 мг симвастатина) фирмы «Мерк Шарп и Доум Б.В.», Нидерланды, серии NJ24240.
Эксперимент выполняли на 60 белых беспородных лабораторных половозрелых самцах-крысах с исходной массой тела 300 -350 граммов, которых содержали на стандартном рационе в условиях экспериментальной клиники в пластиковых клетках. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, запаренные крупы, вареное мясо. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 18 – 22о C, относительная влажность - 50-65%. Температуру и влажность воздуха регистрировали ежедневно.
В опыте животные были разбиты на 4 группы:
1 группа - интактный контроль;
2 группа - атерогенная диета (АД)
3 группа - атерогенная диета + «Зокор» (8 мг симвастатина /кг);
4 группа - атерогенная диета + ЭМВ (50 мг/кг).
Атерогенную диету создавали по методу Н.Н. Аничкова, путем введения животным 10% масляной суспензии холестерола и дополнительно пропилтиоурацил (в дозе 7 мг/кг) для подавления функции щитовидной железы. Суспензию вводили перорально 1 раз ежедневно натощак в течение 14 дней.
Испытываемые вещества «Зокор», экстракт мицелия вешенки (ЭМВ) перед применением развешивали в расчетных дозах и разводили для каждой крысы в 2 мл физиологического раствора.
Все испытываемые вещества вводили крысам перорально с интервалом 3 часа после атерогенной нагрузки в течение последних 10 дней атерогенной диеты.
В конце эксперимента у животных после 18 часов голодания брали кровь из хвостовой вены в центрифужные пробирки. Кровь центрифугировали, отбирали сыворотку и проводили изучение содержания в ней холестерина и триглицеридов.
Анализы проводили унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+», производства США с использованием стандартных наборов реагентов.
Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови.
Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА ФС ДДС» фирмы «ЮНИ-ТЕСТ» кинетическим методом при длине волны 340 нм.
Принцип метода состоит в том, что аланинаминотрансфераза катализирует в присутствии α-кетоглутарата переаминирование L-аланина с образованием пирувата. В присутствии лактатдегидрогеназы происходит окисление НАДН. Скорость окисления НАДН прямо пропорциональна активности аланинаминотрансферазы и измеряется фотометрически при длине волны 340 нм.
Состав набора. Реагент 1: буферно-ферментный раствор, содержащий трис – 100 ммоль/л, L-аланин – 500 ммоль/л, лактатдегидрогеназу – 1200 Е/л, азид натрия – 0,095%. Реагент 2: раствор кофактора и субстрата, содержащий НАДН – 0,18 ммоль/л, α-кетоглутарат – 15 ммоль/л, азид натрия – 0,095%.
Проведение анализа. Рабочий реагент следует нагреть до температуры 37оС в течение 5 минут. Поместить в пробирку 1000 мкл реагента и 100 мкл сыворотки крови, перемешать и инкубировать 1 мин. при 37оС. Измерить оптическую плотность пробы (Е1) при длине волны 340 нм против воздуха; через 1 минуту аналогично измерить оптическую плотность пробы (Е2). Рассчитать ∆Е/мин: ∆Е/мин= Е1 – Е2.
Расчет производят по формуле: А=∆Е/мин х 1745, где А - активность аланинаминотрансферазы, Е/л; ∆Е/мин – измерение оптической плотности пробы за 1 минуту, ед.опт.плотн.; 1745 – фактор пересчета для выражения активности аланинаминотрансферазы в Е/л.
Определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови.
Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗА ФС ДДС» фирмы «ЮНИ-ТЕСТ» кинетическим методом при длине волны 340 нм.
Принцип метода состоит в том, что аспартатаминотрансфераза катализирует в присутствии α-кетоглутарата переаминирование L-аспартата с образованием оксалоацетата. В присутствии малатдегидрогеназы и оксалоацетата происходит окисление НАДН. Скорость окисления НАДН прямо пропорциональна активности аспартатаминотрансферазы и измеряется фотометрически при длине волны 340 нм.
Состав набора. Реагент 1: буферно-ферментный раствор, содержащий трис – 80 ммоль/л, L-аланин – 240 ммоль/л, малатдегидрогеназу – 600 Е/л, лактатдегидрогеназу – 600 Е/л; азид натрия – 0,095%. Реагент 2: раствор кофактора и субстрата, содержащий НАДН – 0,18 ммоль/л, α-кетоглутарат – 12 ммоль/л, азид натрия – 0,095%.
Проведение анализа. Рабочий реагент следует нагреть до температуры 37оС в течение 5 минут. Поместить в пробирку 1000 мкл реагента и 100 мкл сыворотки крови, перемешать и инкубировать 1 мин. при 37оС. Измерить оптическую плотность пробы (Е1) при длине волны 340 нм против воздуха; через 1 минуту аналогично измерить оптическую плотность пробы (Е2). Рассчитать ∆Е/мин: ∆Е/мин= Е1 – Е2.
Расчет производят по формуле: А=∆Е/мин х 1745, где А - активность аспартатаминотрансферазы, Е/л; ∆Е/мин – измерение оптической плотности пробы за 1 минуту, ед.опт.плотн.; 1745 – фактор пересчета для выражения активности аспартатаминотрансферазы в Е/л.
Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.
Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА ФС ДДС» фирмы «ЮНИ-ТЕСТ» кинетическим методом при длине волны 405 нм.
Принцип метода состоит в том, что щелочная фосфатаза катализирует реакцию гидролиза п-нитрофенилфосфата с образованием эквимолярного количества п-нитрофенола и фосфата. Скорость образования п-нитрофенола прямо пропорциональна активности щелочной фосфатазы и измеряется фотометрически при длине волны 405 нм.
Состав набора. Реагент 1: буферный раствор, содержащий диэтаноламин – 1000 ммоль/л, рН 9,8, магний хлористый – 0,5 ммоль/л, азид натрия – 0,095%. Реагент 2: раствор субстрата, содержащий п-нитрофенилфосфат – 10 ммоль/л, азид натрия – 0,095%.
Проведение анализа. Рабочий реагент следует нагреть до температуры 37оС в течение 5 минут. Поместить в пробирку 1000 мкл реагента и 20 мкл сыворотки крови, перемешать и инкубировать 1 мин. при 37оС. Измерить оптическую плотность пробы (Е1) при длине волны 340 нм против воздуха; через 1 минуту аналогично измерить оптическую плотность пробы (Е2). Рассчитать ∆Е/мин: ∆Е/мин= Е1 – Е2.
Расчет производят по формуле: А=∆Е/мин х 2757, где А - активность щелочной фосфатазы, Е/л; ∆Е/мин – измерение оптической плотности пробы за 1 минуту, ед.опт.плотн.; 2757 – фактор пересчета для выражения активности щелочной фосфатазы в Е/л.
Результаты исследования
В таблице 1 приведены усредненные групповые показатели гепатозащитных свойств препарата сравнения «ЗОКОР» и Экстракта мицелия вешенки на фоне приема атерогенной диеты. Анализировалась активность трансаминаз (аланиновая и аспарагиновая) и щелочной фосфатазы.
Таблица 1
Средние показатели биохимического анализа крови животных (активность ферментов)


Группа
животных

Доза

Показатели (М±m)

АлТ

АсТ

ЩФ

Е/л

Контроль инт.

---

43,8±2,40

70,7±3,45

159,0±3,11

АД

---

52,6±1,99*

86,6±5,22*

180,4±10,15

АД+Зокор

8мг/кг

51,4±1,87*

81,6±4,32*

172,6 ±4,29**

АД+ЭМВ

50мг/кг

48,6±2,82

78,4±3,09

170,8±5,09

Примечание: *, ** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю при уровне достоверности 0,05, 0,01 соответственно.
В группе животных, получавших только атерогенную диету, достоверно повысилась активность трансаминаз, по сравнению с интактными животными.
В группе животных, получающих вместе с атерогенной диетой препарат сравнения «Зокор», также наблюдалось достоверное повышение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосатазы. Такое возможное повышение описано и в побочных эффектах в инструкции по применению препарата.
При пероральном введении составляющих веществ экстракта мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в течение 10 суток происходило незначительное повышение активности трансаминаз и ЩФ. Активность АлТ в группах, получающих экстракт вешенки, повысилась лишь на несколько единиц. По способности снижать активность АсТ в крови после атерогенной диеты, исследуемый экстракт мицелия вешенки снижает этот показатель до значения 78,4 Е/л. Аналогичные показатели оказались и в отношении активности ЩФ.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемый препарат оказывает дифференцированное влияние на характер ферментных печеночных показателей.
По снижению активности ферментов в группах, получающих экстракт мицелия вешенки, можно сделать вывод о том, что этот препарат оказывают наиболее благоприятное влияние на работу печени при гиперлипидемии, не вызывая повышения активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, по сравнению с группой, получающей препарат сравнения «Зокор».
Анализ полученных результатов исследований свидетельствует о том, что экстракт мицелия вешенки обладает гепатопротекторной активностью и по своей эффективности превосходит лекарственную форму «Зокор», что позволяет его рекомендовать к изучению по расширенной программе исследования в детоксикационном препарате с полифункциональной медико-биологической активностью.
Summary
Oyster mushroom mycelium extract possesses hepatoprotective activity and its effectiveness is superior dosage form "Zocor", which allows him to recommend to the study on the enhanced program of research in drug detoxification with multifunctional medical and biological activity.