ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137, ОБОГАЩЕННЫХ ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ПРОГРЕССИЮ ДИСЛИПИДЕМИИ, ИНДУЦИРОВАННУЮ АТЕРОГЕННОЙ ДИЕТОЙ

С.В. Захаров,   * Н.В. Перова, В.П. Герасименя,  **В.Ю. Поляков,  **Г.И.  Кирьянов, *Г.А. Духина, Л.П. Семашева,
*** К.З. Гумаргалиева.

 ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;
*Автономная некоммерческая организация «Институт медико-биологических исследований и технологий», Москва, Россия;
 * *Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского  Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва,   Россия;
***Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия.

Среди основных причин смертности взрослого населения экономически развитых стран мира в настоящее время уверенно лидируют сердечно-сосудистые заболевания. В современной России они составляют около 57 % от общей смертности. Самыми распространенными причинами сердечно-сосудистых заболеваний являются высокие показатели артериального давления (гипертензия) и аномально повышенный уровень липидов (в частности, холестерина) и/или липопротеинов в крови (гиперлипидемия).
В настоящее время наиболее эффективными лекарственными препаратами, снижающими уровень «плохого» холестерина и, соответственно, вероятность сосудистых заболеваний, являются статины. Статины оказывают ингибирующее воздействие на З-гидрокси-3-метил-глютарил-коэнзим А(ГМГ-КоА)-редуктазу – фермент, катализирующий начальную стадию биосинтеза холестерина. В связи с тем, что конверсия ГМГ-КоА в мевалонат представляет собой ранний этап биосинтеза холестерина, считается, что применение статинов не должно вызывать накопления в организме потенциально токсичных стеролов. Тем не менее, одним из основных противопоказаний к применению статинов являются заболевания печени. В связи с этим, представляется актуальным поиск новых лекарственных препаратов, которые нормализуют липидный обмен и при этом не обладают токсическим действием на клетки печени.
Большой терапевтический потенциал для коррекции сердечно сосудистой патологии имеют вещества, выделенные из плодовых тел медицинских грибов - полисахариды, в том числе, β-глюканы, и тритерпеновые кислоты, которые обладают иммуномодулирующими свойствами. Медицинские грибы являются одним из природных источников антигиперлипидемических средств. По мнению ряда авторов, все известные медицинские грибы и, в особенности, Pleurotus, Lentinusand Grifola, широко использующиеся в традиционной китайской медицине иотличающиеся высоким содержанием клетчатки, стеролов, белков, микроэлементов и низкой калорийностью, представляют собой идеальную диету для предотвращения сердечно сосудистых заболеваний (Breene, 1990; Hobbs, 1995).
Ранее на модели экспериментального неалкогольного стеатогепатита нами было изучено гепатопротекторное действие лекарственного препарата (инцистерола), полученного на основе водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки [1,2,3].    Показано, что развитие деструктивных изменений печени, вызванных атерогенной диетой, блокируется как на уровне общей организации печени, так и на клеточном уровне. Важно, что при этом биохимические пробы указали на тенденцию к нормализации показателей липидного обмена в крови подопытных животных.
В настоящей работе проведено детальное исследование действия инцистерола и других фракций экстракта на дислипидемию у крыс, вызванную атерогенной диетой.
Эксперименты выполняли на белых беспородных лабораторных половозрелых  крысах (самцах) с исходной массой тела 300 - 350 граммов, полученных из питомника лабораторных животных ФГУП ОПХ «Манихино» 10 марта 2009г., вет. свидетельство  № 0010101.
Животных содержали в пластиковых клетках на стандартном рационе (комбикорм, свежие овощи, запаренные крупы, молоко, вареное мясо) в условиях свободного доступа к воде и корму. Освещение вивария искусственное: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Температуру воздуха поддерживали в пределах 18 - 22°C, относи-тельную влажность 50 - 65%.

В опыте животные были разбиты на три группы.

1 группа - контроль.
2 группа - атерогенная диета. Атерогенную диету создавали, вводя животным 10% суспензии холестерина на рафинированном растительном масле с добавлением пропилтиоурацила (из расчета 5 мг/кг живой массы) для подавления функции щитовидной железы. Суспензию вводили натощак перорально 1 раз в день, ежедневно в течение 14 дней.
3 группа - экспериментальные животные. На фоне атерогенной диеты животные получали препараты хроматографически очищенных фракций экстракта мицелия вешенки Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F–819).
Для подавления синтеза эндогенного холестерина исполь-зовался Зокор (симвастатин) («Мерк Шарп и Доум Б.В.»), Нидер-ланды, серия NJ41170.
Препараты вводили животным перорально с интервалом 3 часа после атерогенной нагрузки в течение последних 10 дней атеро-генной диеты.
В течение всего эксперимента следили за выживаемостью, общим видом, состоянием и поведением животных, фиксировали изменение массы тела (взвешивание крыс проводили один раз в неделю).
Биохимические анализы
Кровь у контрольных и экспериментальных животных забирали методом декапитации.
В эксперименте по реабилитации анализ проводили на индивидуальных животных: сразу после прекращения действия фракций испытываемого препарата кровь забирали из хвостовой вены, по окончании эксперимента – методом декапитации.
Кровь центрифугировали и полученную сыворотку использовали для проведения биохимических анализов. Анализы проводились унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+», производства США с исполь-зованием стандартных наборов реагентов.
Общий холестерин. Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН CHOL FS» (DiaSys) ферментативным фотометрическим методом.
Холестерин липопротеинов высокой плотности. Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН ЛПВП ФС» (Диакон-ДС) ферментативным фотометрическим методом при длине волны 500 (480 – 520) нм.
Триглицериды. Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ТРИГЛИЦЕРИДЫ ФС» (Диакон-ДС) фотометрическим методом при длине волны 500 (480 – 520) нм.
Холестерин липопротеидов низкой и очень низкой плотности. Зная количество холестерина ЛПВП, холестерин ЛПНП можно определить по схеме, основанной на формуле Фридвальда:
ЛПНП (ммоль/л) = ХС (ммоль/л) – ТГ (ммоль/л)/2,2 – ЛПВП (ммоль/л).
Содержание холестерина ЛПОНП рассчитывали по формуле:
ЛПОНП (ммоль/л) = ТГ(ммоль/л)/5.
На основании результатов анализа вычисляли индекс атерогенности, равный разности содержания общего холестерина (ХС) и холестерина в липопротеинах высокой плотности (ХС ЛПВП), отнесенной к содержанию ХС ЛПВП (индекс атерогенности = (ХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП).
К (атер.,у.е.) = (ХС – ЛПВП)/ЛПВП.
Аланинаминотрансфераза. Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА ФС ДДС» фирмы «ЮНИ-ТЕСТ» кинетическим методом при длине волны 340 нм.
Щелочная фосфатаза.  Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА ФС ДДС (ЮНИ-ТЕСТ) кинетическим методом при длине волны 405 нм.
Общий билирубин. Определение содержания билирубина в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «Билирубин ДДС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.
Общий белок. Определение содержания общего белка в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ОБЩИЙ БЕЛОК ФС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.
Глюкоза. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «Глюкоза ФС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.
Световая и электронная микроскопия
Для гистологического и ультраструктурного анализа небольшой фрагмент печени отделяли ножницами, переносили в 4% р-р глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере Зеренсена. Фрагмент разрезали бритвенным лезвием на кусочки объемом около 1 мм3, полученные образцы переносили в свежую фиксирующую смесь того же состава. Фиксацию проводили при комнатной температуре в течение 4-х часов. Затем образцы промывали в дистиллированной воде и постфиксировали 1% водным раствором тетроксида осмия в течение 12 часов при +4 ºС. Образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (70% этанол содержал 2% уранилацетата), ацетоне и заключали в эпоксидную смолу по стандартной методике.
Для гистологического анализа с помощью ультрамикротома Ultracut E (Reicher Jung) изготавливали «полутонкие» срезы толщиной около 1 мкм, окрашивали срезы метиленовым синим и изучали с помощью светового микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss) с использованием объективов ×10 и ×100.
Для электронной микроскопии получали ультратонкие срезы толщиной около 80 нм, контрастировали их 1%-ным водным раствором уранилацетата 20 минут и цитратом свинца и фотографировали в электронном микроскопе Hitachi H-700 (Япония).
Патоморфологические исследования
После окончания эксперимента с помощью передозировки наркоза проводили эвтаназию для патоморфологических исследований внутренних органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патолого-анатомической схеме. Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов AJ-CE/AJH-CE фирмы “Shinko Denshi CO.Ltd”, Япония с последующим вычислением массы печени,  отношения массы печени к массе тела  и их стандартных отклонений.
Статистический анализ.
Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Достоверным считали различие данных групп при р<0,05.

  Результаты исследования
  Характеристика фракций экстракта мицелия вешенки:

1. Ф1 - фракция без инцистерола;
2. Ф2 - фракция инцистерол;
3. ФС - суммарная фракция Ф1 + Ф2 (фракция ХМ );
4. (ЭМВ сироп +βГ) - «ОВОДОРИН» сироп + β 1-3 глюкан;
5. ФС 2 - фракция ХМ 2 мкг;
6. ФС 4 - фракция ХМ 4 мкг;
7. ГВ - очищенный от инцистерола экстракт ЭМВ  в виде геля;
8. ЭМВ - суммарный экстракт ЭМВ в виде геля («ОВОДОРИН»);
9. ФС +βГ - фракция ХМ +β 1-3 глюкан.

Атерогенная диета индуцирует дислипидемию у подопытных животных.
В таблице 1 и на рисунке 1 представлены результаты действия атерогенной диеты на обмен холестерина и ЛП в крови экспериментальных животных.
Таблица 1  - Результаты действия атерогенной диеты на обмен холестерина и ЛП в крови экспериментальных животных

 

Группа
животных

Показатели (М±m)

ХС общ.

ТГ

ХС ЛПВП

ХС ЛПНП

ХС ЛПОНП

Индекс атерогенности

Ммоль/л

У.е.

Контроль

2,0±0,11

1,0±0,09

0,7±0,01

0,8±0,09

0,5±0,04

1,8±0,16

АД

***
3,0±0,18

***
1,5±0,12

***
0,6±0,01

**
1,6±0,17

**
0,7±0,06

***
3,7±0,28

*, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю


Рисунок 1 - Действие атерогенной диеты на метаболизм липидов (Опыт 3).

Анализ полученных данных (таблица 1, рисунок 1) показывает, что в группе животных, находившихся на атерогенной диете, по отношению к контролю наблюдаются достоверное повышение содержания общего холестерина, триглицеридов и липопротеинов низкой и очень низкой плотности. При этом снижается уровень липопротеинов высокой плотности (Рисунок 1). В результате, у экспериментальных животных резко (примерно в 2 раза) возрастает индекс атерогенности (Рисунок 1). Таким образом, использованная методика атерогенной диеты вызывает выраженую дислипидемию у крыс.

Эффективность антиатерогенного действия различных фракций ЭМВ существенно различается
В таблице 2 суммированы данные трех экспериментов по анализу действия различных фракций ЭМВ на прогрессию дислипидимии, индуцированную атерогенной диетой. Исследованные вещества можно разделить на 2 группы. Фракции, обедненные инцистеролом (Ф1, ГВ) и фракции, содержащие инцистерол в различных количествах, в том числе обогащенная инцистеролом фракция (Ф2). Полученные данные показывают, что все фракции снижают долю общего холестерина и атерогенных липопротеинов (аЛП) (таблица 2).  
Таблица 2 - Средние показатели липидногой обмена контрольных и экспериментальных животных

 

Группа
животных

Показатели (М±m)

 

ХС
общ.

 

ТГ

 

ХС
ЛПВП

 

ХС
ЛПНП

 

ХС
ЛПОНП

 

индекс
атер.

Ммоль/л

У.е.

 

Контроль

2,0±0,11
2,0±0,17
--------

1,0±0,09
0,9±0,08
--------

0,7±0,01
0,7±0,04
-------

0,8±0,09
0,9±0,16
-------

0,5±0,04
0,4±0,04
-------

1,8±0,16
1,8±0,23
--------

 

АД

***
2,9±0,23

***
3,0±0,18

2,8±0,20

1,2±0,07

***
1,5±0,12

0,7±0,06

***
0,6±0,02

***
0,6±0,01

0,6±0,1

**
1,8±0,25

**
1,6±0,17

1,9±0,21

0,5±0,03

**
0,7±0,06

0,3±0,02

**
3,7±0,41

***
3,7±0,28

3,4±0,29

 

АД+ФС
2 мкг/кг

#
2,1±0,11
--------
*
2,3±0,14

##
0,9±0,06
---------

0,7±0,05

##
0,7±0,01
-------
***
0,8±0,03

#
1,1±0,13
--------
*
1,2±0,12

##
0,4±0,03
-------

0,3±0,02

##
2,1±0,17
-------
**
1,9±0,17

 

АД+Ф1
2 мкг/г

#
2,3±0,15
------
-------

##
0,9±0,05
--------
-------

##
0,7±0,01
-------
-------

1,2±0,17
-------
-------

##
0,4±0,03
--------
--------

##
2,2±0,20
--------
--------

 

АД+Ф2
2 мкг/г

 

2,2±0,39
-------
--------

##
0,8±0,08
-------
-------

##
0,7±0,01
-------
-------

 

1,1±0,38
--------
--------

##
0,4±0,04
--------
-------

##
1,9±0,53
-------
-------

АД+ЭМВ сироп
4 мл/кг

2,2±0,30
##
2,2±0,12
-------

*    ###
0,8±0,05
###
0,8±0,04
-------

##
0,7±0,01
###
0,7±0,02
--------

1,2±0,29
##
1,1±0,12
-------

*   ###
0,4±0,02
###
0,4
-------

#
2,3±0,38
##
2,3±0,20
--------

АД+(ЭМВ+βГ) сироп
4мл/кг

*   #
2,3±0,07
-------
-------

*   ###
0,7±0,06
-------
-------

##
0,7±0,02
-------
-------

**  
1,3±0,06
-------
-------

**   ###
0,3±0,02
-------
-------

*   ##
2,3±0,10
--------
-------

 

АД+ФС 2
2мкг/г

--------
###
2,0±0,16
-------

--------
##
1,1±0,13
-------

--------
###
0,7±0,01
-------

--------
###
0,8±0,16
-------

--------
##
0,5±0,06
-------

--------
###
2,0±0,24
--------

АД+ФС 4
4мкг/г

--------
#
2,3±0,15
-------

-------
##
1,2±0,15
-------

--------
###
0,7±0,01
-------

--------
##
1,0±0,12
-------

--------
##
0,5±0,07
-------

--------
###
2,2±0,21
--------

АД+ГВ
50мг/кг

-------
#
2,3±0,12
-------

-------
###
0,8±0,08
-------

-------
###
0,7±0,01
-------

-------
##
1,2±0,09
-------

-------
###
0,4±0,04
-------

--------
##
2,4±0,17
--------

АД+ЭМВ
50мг/кг

--------
##
2,4±0,09
-------

--------
###
0,9±0,10
-------

--------
###
0,7±0,01
-------

-------

1,3±0,12
-------

--------
##
0,4±0,04
-------

--------
*    ##
2,5±0,17
--------

АД+ФС +βГ
2мкг/мл+20мкг/мл

-------
-------
**  ##
2,2±0,23

-------
-------
** ###
0,5±0,03

-------
-------
**###
0,7±0,02

-------
-------
*   ##
1,2±0,14

-------
-------
**  ###
0,2±0,01

--------
--------
**    ###
2,0±0,17

Верхние строки в ячейках - опыт №2, средние - №3, нижние - №4;
*, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0,001 соответственно;
#, ##, ### - достоверные отличия по отношению к группе с атерогенной диетой при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0,001 соответственно;
-------- - данные отсутствуют.

Эффективность действия различных фракций ЭМВ на обмен липидов хорошо иллюстрируется обобщающим показателем, который называют «индексом атерогенности» (рисунок 2).  По этому показателю наибольшую эффективность показывают фракции, содержащие в своем составе инцистерол (ФС 2 и ФС +βг) и фракция, обогащенная инцистеролом (Ф2), (рисунок  2) .


Рисунок 2 - Индекс атерогенности исследуемых препаратов Зокор, детоксикационного препарата и его составляющих веществ на фоне атерогенной диеты.

Именно эти фракции были отобраны для дальнейшего анализа.
В графическом виде конкретные показатели метаболизма холестерина и липопротеинов при совместном действии атерогенной диеты и фракций Ф2, ФС2 и ФС+βг приведены на рисунках 3 - 9.


Рисунок 3 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на липидный обмен на фоне  атерогенной диеты.


Рисунок 4 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на липидный обмен на фоне атерогеннной диеты.


Рисунок 5 - Действие   фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных общего холестерина на фоне атерогеннной диеты.


Рисунок 6 - Действие   фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных триглицеридов на фоне атерогеннной диеты.


Рисунок 7 - Действие   фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПНП на фоне атерогеннной диеты.


Рисунок 8 - Действие   фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПОНП на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 9 - Действие   фракций экстракта мицелия вешенки  на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПВП на фоне атерогеннной диеты.

Как видно, их действие на фоне АД существенно снижает долю общего холестерина (рисунок 5). При этом наблюдается снижение уровня триглицеридов (ТГ) (рисунок  6),   липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (рисунок 7) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) (рисунок 8).   Повышается доля липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рисунок  9).

Читать дальше ›››