ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ   ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus  1137  У  ЖИВОТНЫХ НА МОДЕЛИ СОЛИДНОЙ ОПУХОЛИ МЕЛАНОМА В-16


С.В. Захаров,  В.П. Герасименя,  *В.Ю. Поляков,  *Г.И. Кирьянов, Л.П. Семашева, **К.З. Гумаргалиева

ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;
*Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского  Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;
 **Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия.

Исследования проводились на базе Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля  РАН  (Москва)   при участии  ученых и специалистовООО «Инбиофарм» (Москва),Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского  Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (г. Москва) и Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН (Москва) под научным руководством доктора биологических наук, профессора Островской Л.А.

 Материалы и методы
При изучении противоопухолевой активности препарата   у мышей на модели солидной опухоли меланома В-16 были прове-дены четыре серии экспериментов.
В первой серии экспериментов исследовалась противоопухолевая активность детоксикационного препарата в виде геля и сиропа и его составных частей на модели солидной опухоли меланома В-16.
     Эксперименты проведены на инбредных мышах BDF1 - гибриды первого поколения f1(C57Bl6 x DBA2) из питомника РАМН «Столбовая». В опытах использовано 100 мышей, самцов с массой тела 18–20 г.
В качестве опухолевой тест-системы служила перевиваемая солидная опухоль животных меланома В-16. Опухоль перевивалась в соответствии со стандартным регламентом под кожу правого бока мышей измельченными фрагментами опухолевой ткани, содержа-щимися в 0,3 мл физиологического раствора хлористого натрия [1].
В первой серии эксперимента подвергались испытанию 5 групп мышей (по 8 мышей в каждой группе) [2].
Во второй третьей и четвертой сериях эксперимента подвергались испытанию по 3 группы мышей (по 8 мышей в каждой группе) [3].
Ежедневно во всех группах четырех серий эксперимента проводили осмотр животных для оценки наличия и степени выраженности опухоли (визуально и пальпаторно), а также признаков возможной интоксикации. Фиксировали: среднюю массу опухоли (г); торможение роста опухоли (ТРО) (в %); среднюю продолжительность жизни животных (сутки); увеличение средней продолжительности жизни животных экспериментальных групп относительно продолжительности жизни животных контрольной группы (в %).
Наблюдение за животными продолжалось в течение всего периода развития опухоли вплоть до гибели животных.
Статистическая обработка  данных проведена с использованием пакета компьютерных программ «Statistica 6.0». Оценка достоверности различий между средними значениями, характеризующими массу опухоли в группах контрольных и леченных животных, проведена с помощью  t-критерия Стьюдента. Различия между леченными и контрольными группами животных  признаются достоверными при условии, что вычисленные  значения t превышают значения критерия Стьюдента для определённых уровней значимости при заданном числе степеней свободы f  [4].
Результаты  экспериментов представлены в виде кинетических кривых, каждая точка которых соответствует данным, полученным от 6 животных. 
Основные результаты исследований
Результаты исследований четырех серий экспериментов приведены в таблицах 1 - 4 и на рисунках  1 - 9.
При анализе представленных в табл.  1  и показанных на рис. 1 - 8 данных динамики изменения контролируемых показателей противоопухолевой активности веществ установлена зависимость их активности от типа применяемого состава. Из изученных четырех составов индивидуального применения препарата наибольшее торможение роста опухоли вызвали варианты препарата   в виде геля (4-я группа) и сиропа (5-я группа), которое соответственно на 21-е сутки после перевивки мышам опухоли составили 61% и 55%. При этом средний объем опухоли у мышей этих групп, по сравнению с интактным контролем (1-я группа), на 21-е сутки уменьшился соответственно в 2,9 и 2,5 раза.
Средняя продолжительность жизни животных, принимавших   препарат увеличилась по сравнению с группой интактного конт-роля, соответственно на 117% и 109,5% и значительно превосходила среднюю продолжительность жизни животных, применяя-вших фармакологическую субстанцию препарата (2-я группа) или его активное начало (3-я группа).
Для наглядной оценки противоопухолевого эффекта  препарата в виде геля и сиропа на всем протяжении рост-ингибирующего эффекта опухоли меланома В-16 полученные данные представлены в виде зависимостей, характеризующих динамику изменения размеров опухоли у леченых животных в процентах по отношению к контролю (показатель Т/С %, см. рисунки  4, 7).  
Приведенные на этих рисунках зависимости подтверждают эффективность торможения роста опухоли на протяжении наблю-даемого периода ее развития, которые по выраженности и характеру противоопухолевого действия имеют свою индивидуальность.
Установлено, что спустя 11 суток после окончания курса терапии препарат в виде геля или сиропа оказывает устойчивое противо-опухолевое действие, сохраняющееся на уровне 55-60%.
После исследования противоопухолевой активности препарата у животных после их гибели (на 43 сутки перевивки опухоли) извлекалась оставшаяся часть опухоли, и проводились гистоло-гические исследования. В результате проведенных исследований было установлено, что у леченой опухоли нет четко выраженной зональности. Под поперечнополосатой мускулатурой присутствуют множественные очаги некротической гибели клеток. Под слоем мышечных волокон располагаются сосуды с клетками крови и многочисленные апоптотические клетки.
Многочисленные мелкие сосуды пронизывают опухоль, для клеток которой характерна базофилия, ядра гетерогенны по размеру и форме. В опухоли присутствуют многочисленные меланоциты с гранулами. Обширные очаги некроза проникают вглубь опухоли. В составе опухоли на границе лейкоцитарного вала, часто в отдельных лакунах выявляются апоптотические клетки с характерными выростами мембран и гетеропикнотичными ядрами. Зоны некроза окружены лейкоцитарным валом (воспаление) из лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов.
Таким образом, в результате индивидуального применения   препарата в первые 1-10 суток после перевивки мышам солидной опухоли меланома В-16 сделано заключение о том, что оставшаяся после лечения часть опухоли пронизана многочисленными очагами некротической и апоптотической гибели клеток. Опухоль активно разрушается.
При анализе представленных в таблицах 2 - 4 и показанных на рис. 9  данных динамики изменения контролируемых показателей противоопухолевой активности исследуемых фармакологической субстанции и активного вещества 4-hydroxy-17R–methylincisterol  (таблицы 2, 3), а также непосредственно разработанного препарата в виде сиропа (таблица 4, рисунок 9) при их сочетанном применении с ЦФ установлена зависимость активности от применяемого состава.
В результате проведенной серии экспериментов показано, что совместное применение исследуемых составов веществ и ЦФ вызывает глубокое торможение роста опухоли меланома В-16, изменяющееся в пределах от 70% до 96%, по сравнению с нелеченным интактным контролем мышей.
При этом средний объем опухоли у мышей этих групп по сравнению с интактным контролем (1-я группа) уменьшился практически на всем протяжении при испытании фармакологической субстанции с ЦФ в 14,3 раз (таблица 2), при испытании активного вещества 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата с ЦФ в 3,75 раза (таблица 3) при испытании препарата в виде сиропа с ЦФ в 23 раза (таблица 4, рисунок .9).
Обобщая результаты изучения эффективности сочетанного комбинированного применения   препарата    в виде сиропа в дозе 100 мг/кг в течение первых 1…10 суток и ЦФ в дозе 50 мг/кг однократно, в первые сутки после перепрививки опухоли, можно сделать вывод, что такая схема практически приводит к полному ингибированию роста опухоли по сравнению с интактным неле-ченным контролем, не оказывая при этом отрицательного влияния на противоопухолевый эффект цитостатика.
Более того, необходимо подчеркнуть, что обладая детоксицирующим действием, разработанный препарат существенным образом улучшает клиническую картину «качества жизни» животных (активность, внешний вид, состояние шерсти, поведенческие реакции, масса тела, отсутствие диареи) по сравнению с животными, получавшими только циклофосфан, а также по сравнению с нелеченными мышами интактного контроля.

Таблица 1 - Результаты оценки противоопухолевой активности заявляемого препарата в виде геля и сиропа и его составных частей на модели солидной опухоли меланома В-16



групп

Характер групп

Суточная
доза
(мг/кг)

Средний объём опухоли
(см3)

ТРО
(%)

Средняя продолжительность жизни животных (сутки)

Увеличение средней продолжительности жизни животных
(%)

1

Интактный контроль

-

8,6±1,6*

-

19,6±1,6

0

2

Фармакологическая субстанция
препарата

100

5,4±1,6*

36 на
13 сут

21,2±3,7

7

3

Активное начало
препарата

2

4,5±0,55*

20 на
18 сут

25,0±0,9

25

4

Препарат в виде геля

100

3,0±1,9*

61 на
21 сут

43,0±2,1

117

5

Препарат в виде сиропа

75

3,5±1,8*

55 на
21 сут

41,5±2,8

109,5

Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

Таблица 2 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения фармакологической субстанции препарата в виде геля и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16  (вторая серия экспериментов)



групп

Характер групп

Суточная
доза
(мг/кг)

Средний объём
опухоли
(см3)

ТРО
(%)

Средняя
продолжительность жизни
животных (сутки)

Увеличение средней
продолжи тельности
жизни животных
(%)

1

Интактный контроль

-

8,6±1,6*

-

19,6±1,6

-

2

ЦФ

100

0,3±0,02*

96 на 13 сут

29,7±2,9

50

3

Фармакологическая субстанция
препарата в виде геля + ЦФ

100 + 100

0,6±0,02*

93 на 13 сут

30,2±3,0

54

Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

Таблица 3 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения активного вещества производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата в виде геля и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (третья серия экспериментов)



групп

Характер групп

Суточная
доза
(мг/кг)

Средний
объём
опухоли
(см3)

ТРО
(%)

Средняя продолжи тельность жизни животных (сутки)

Увеличение средней продолжительности жизни животных
(%)

1

Интактный контроль

-

6,0±2,8*

-

26,8±2,7

-

2

ЦФ

100

1,6±0,2*

73 на 21 сут

34,8±3,0

30

3

Активное начало
препарата + ЦФ

2 + 50

1,8±0,9*

70 на 21 сут

36,4±4,5

36

Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 21-е сутки после перевивки опухоли.
Таблица 4 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения препарата в виде сиропа и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (четвертая серия экспериментов)



групп

Характер групп

Суточная
доза
(мг/кг)

Средний объём
опухоли
(см3)

 ТРО
(%)

Средняя продолжительность жизни животных(сутки)

Увеличение средней продолжи тельности жизни животных
(%)

1

Интактный контроль

-

4,6±1,6*

-

19,8±1,6

-

2

ЦФ

50

0,1±0,02*

98 на 14 сут

22,7±6,2

15

3

Препарат в виде сиропа + ЦФ

100 + 50

0,2±0,01*

96 на 14 сут

22,4±6,3

15

Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

 

Рисунок 1 - Результаты противоопухолевой активности фармакологической субстанции препарата в виде геля на модели солидной опухоли меланома В-16

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением фармакологической субстанции препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

 

Рисунок 2 - Результаты противоопухолевой активности активного вещества производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата на модели солидной опухоли меланома В-16

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением активного начала производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol в дозе 2 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток. 


Рисунок 3 - Результаты противоопухолевой активности препарата в виде геля на модели солидной опухоли меланома В-16

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 4 - Результаты ингибирования роста солидной опухоли меланома В-16 у мышей под влиянием введенного препарата в виде геля

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.


Рисунок 5 - Диаграмма выживаемости мышей с солидной опухолью меланома В-16 у мышей, получивших препарат в виде геля

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;
2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 6 - Результаты противоопухолевой активности препа-рата в виде сиропа на модели солидной опухоли меланома В-16

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 7 - Результаты ингибирования роста солидной опухоли меланома В-16 у мышей под влиянием введенного препарата в виде сиропа

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно ежедневно в течение 1…10 суток. 


Рисунок 8 - Диаграмма выживаемости мышей с солидной опухолью меланома В-16 у мышей, получивших препарат в виде сиропа

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;
2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.


Рисунок 9 - Результаты противоопухолевой активности сочетан-ного применения препарата в виде сиропа и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (4-я серия экспериментов)

1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;
2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки;
3 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением сочетанного применения ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки и препарата в виде сиропа в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1...10 суток.
Список литературы:
1. Трещалина Е.М. «Методические указания по изучению противо-опухолевой активности фармакологических веществ»: книга «Руко-водство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ»/ Е.М. Трещалина, О.С. Жукова, Г.К. Герасимова, Н.В. Андронова, А.М. Гарин; под  ред. Р.У.Хабриев), издание 2. -М. : «Медицина», 2005.   С. 637-651.
2. Экспериментальное исследование противоопухолевой активно-сти препаратов мицелия вешенки: отчет о НИР  / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 25с.
3.Экспериментальное исследование in vivo противоопухолевой активности препаратов выделенных из мицелия грибов Pleurotus ostreatus: отчет о НИР  / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 29с.
4. Бейли Н. «Статистические методы в биологии»// М., Изда-тельство иностранной литературы, 1962,  -251 с.