ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИИ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ, ОБОГАЩЕННОЙ  ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ


С.А. Голышев,  Г.И. Кирьянов, Л.Н. Кинцурашвили,
*С.В. Захаров,  *В.П. Герасименя,  В.Ю. Поляков

 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского  Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва,   Россия;
*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Ранее  [1,2]  было показано, что мишенью апоптогенного действия экстракта мицелияPleurotusostreatus1137 является рецептор-зависимый («внешний») сигнальный путь, но не митохондриальный («внутренний») сигнальный путь.
В этом контексте фундаментальное значение имеет установление конкретных участников суперсемейства TNF-рецепторов в процессе индукции апоптоза и возможное привлечение других рецепторов, прямо или опосредованно участвующих в реализации программы «клеточной смерти».
В связи с тем, что домены TNF-рецепторов, связывающие разного рода лиганды-индукторы апоптоза, экспонированы на поверхности клеток, возникла идея о подавлении их активности с помощью сшивающего белки агента - глутарового альдегида.
Нами было показано, что обработка клеток низкими концентрациями глутарового альдегида приводит к модификации плазматических мембран, в результате чего клетки теряют способность адаптации к гипотонической среде и из цитоплазматического компартмента частично элиминируются ионы Ca2+.
Механизм взаимодействия глутарового альдегида с белками до конца не изучен, но, в целом, схему реакции можно представить в следующем виде:
1. ε-NH2+O=CH (CH2)3CH=O→ε-N=CH (CH2)3CH=O;
2. ε-N=CH (CH2)3CH=O+NH2-белок→ε-N=CH (CH2)3CH=N-белок.
Поскольку глутаровый альдегид, как «сшивающий» агент, не обладает ярко выраженной избирательностью по отношению к различным типам белков, логично допустить, что его ингибирующее действие может влиять на функционирование широкого спектра рецепторов, экспонированных на внешней поверхности клеток, в том числе и на рецепторы ионных каналов.
В любом случае, ответ клеток с модифицированными мембранами на действие лекарственных препаратов - агонистов апоптоза представляет большой теоретический и практический интерес.
Работа проводилась на трансформированных клетках (HeLa).
Клетки культивировались в среде ДМЕМ с добавлением эмбриональной сыворотки теленка и антимикотика (Sigma) в течение 3 дней, до стадии монослоя (фаза наибольшей метаболической активности клеток).
В качестве исследуемого реагента использовался препарат, обогащенный инцистеролом (фракция ХМ).

Инсталляция фракции, обогащенной инцистеролом, в среду культивирования трансформированных клеток с модифицированными плазматическими мембранами потенцирует апоптотгенное действие.
 Для проверки действия глутарового альдегида как реагента, модифицирующего плазматические мембраны клеток HeLa, использован подход, ранее разработанный на модели клеток культуры ткани СПЭВ, адаптирующихся к гипотонической среде (Зацепина и др., 1982).По данным прижизненных наблюдений, первой реакцией клеток СПЭВ на гипотонический шок, вызванный 30% раствором Хенкса, является быстрая (1-2 мин) декомпактизация митотических хромосом и сильное набухание интерфазных ядер. Через 10-15 мин начинается реконденсация хромосом, которая завершается на 25-30 минуте после начала воздействия. Через 1,5-2 часа хромосомы переходят в интерфазное состояние, что тестируется по формированию в цитоплазме делящихся клеток многочисленных микроядер, в которых восстанавливается репликация ДНК и транскрипция РНК (Киреев и др., 1988).
Клетки СПЭВ, обработанные глутаровым альдегидом, теряют способность к адаптации к гипотонической среде, в результате хромосомы в них не реконденсируются и, соответственно, не формируются микроядра. Логично предположить, что этот феномен прямо или косвенно связан с нарушением транспорта ионов Ca2+. Действительно, по данным прямых измерений в модифици-рованных клетках концентрация Ca2+ остается резко пониженной по сравнению с контролем и не восстанавливается за все время наблюдений. Быстрой реконденсации хромосом и образования микроядер в этом случае удается достигнуть добавлением к среде инкубации кальциевого ионофора А308. Таким образом, в использованной модельной системе (клетки СПЭВ) глутаровый альдегид модифицирует, по крайней мере, один из типов клеточных рецепторов, а именно ионные каналы.
Для клеток СПЭВ показано, что эффективная в отношении модифицирующего действия и нетоксичная концентрация глутаро-вого альдегида составляет 0,001%. Именно в этих условиях глутаровый альдегид блокирует процесс адаптации клеток к условиям гипотоничной среды, но при этом не вызывает их гибели.
Предварительные эксперименты, проведенные на клетках HeLa, показали, что такая концентрация глутарового альдегида токсична для этого типа клеток.
Это потребовало проведения специальной работы по определению минимальной эффективной концентрации глутаро-вого альдегида, во-первых, не влияющей на жизнеспособность клеток и, во-вторых, блокирующей их адаптационный потенциал.
Для определения жизнеспособности клеток в условиях эксперимента использовали прижизненные наблюдения. Надежным показателем жизнеспособности клеток являются активные движения цитоплазматических органоидов, которые можно регистрировать методом цейтраферной съемки. В использованной модельной системе (клетки HeLa, растущие на полной среде с добавлением сыворотки) глутаровый альдегид в концентрации 0,001% вызывает остановку внутриклеточных движений, что принято интерпретировать как свидетельство гибели клеток.
Отсутствия токсического действия глутарового альдегида удалось добиться при его концентрации 0,0001%. При этом наиболее достоверные и повторяющиеся результаты получены на клетках, растущих в среде без добавления сыворотки. С помощью прижизненных наблюдений показано, что в этих условиях полностью сохраняется подвижность цитоплазматических компонентов в течение как минимум 7,5 часов. Важно, что при этом после предварительного гипотонического шока наблюдается эффективное подавления формирования микроядер, что указывает на изменение осмотических свойств плазмалеммы. На основании этих данных для модификации плазматических мембран клеток HeLa в дальнейших экспериментах (а) использовался глутаровый альдегид в концентрации 0,0001% и (б) экспериментальные и контрольные клетки росли в среде без сыворотки.
В культивируемых клетках глутаровый альдегид потенцирует активность факторов апоптоза, присут-ствующих в среде инкубации.
К клеткам, растущим в среде без сыворотки, добавляли глутаровый альдегид в концентрации 0,0001%. После инкубации в течение восьми часов клетки фиксировали параформальдегидом, окрашивали флуорохромом Хехст и заключали в мовиол. Для определения доли митотических и апоптотических клеток анализировали не менее 3000 клеток  (рисунок 1).


Рисунок 1 - Действие глутарового альдегида на апоптоз и пролиферацию клеток HeLa в условиях эксперимента.

Приведенные на рисунке 1 полученные данные показывают, что глутаровый альдегид мало влияет на пролиферативную активность популяции и примерно в 4 раза увеличивает долю апоптотических клеток.
В культивируемых клетках фракция, обогащенная инцистеролом, потенцирует апоптогенное действие глутарового альдегида.
На основании полученных данных были поставлены экспе-рименты по изучению сочетанного действия фракции, обогащенной инцистеролом, и глутарового альдегида. Эксперименты проводили по следующей схеме: клетки помещали в среду культивирования без сыворотки с добавлением 0,0001% глутарового альдегида и инкубировали в течение 30 минут, после чего вносили аликвоты тестируемого препарата. Конечные концентрации - 10, 25, 50, 100, 200 и 500 мкг/мл, финальная концентрация растворителя (этилового спирта) в рабочем растворе составляла 1%. В присутствии реагентов клетки инкубировали в течение 7,5 часов. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 2.


Рисунок  2 - Действиефракции, обогащенной инцистеролом,   на клетки HeLa в присутствии глутарового альдегида в условиях эксперимента.

Полученные результаты (рисунок 2) показывают, что после инсталляции фракции, обогащенной инцистеролом в концентрации 50 мкг/мл, резко возрастает митотический индекс. По данным морфологического анализа большинство митозов имеют различную степень патологии (трехполюсные митозы, отставание хромосом, хромосомные аберрации). По данным литературы такого рода нарушения являются характерными признаками гибели клеток по типу, называемому «митотической катастрофой».
При концентрации 100 мкг/мл фракция, обогащенная инцистеролом, потенцирует апопоптогенное действие глутарового альдегида (количество апоптотических клеток возрастает примерно в 2 раза по сравнению с глутаровым альдегидом и в 10 раз по сравнению с контролем). Снижение митотического индекса при этой концентрации фракции, обогащенной инцистеролом,   можно объяснить переходом клеток с признаками «митотической катастрофы» в апоптоз, что хорошо соответствует данным литературы.
Следует отметить два важных факта.
1. После модификации плазматических мембран фракция, обогащенная инцистеролом, проявляет митостатическую актив-ность уже при концентрации 50 мкг/мл, а апоптогенную активность - при концентрации 100 мкг/мл. В клетках с немодифицированными мембранами, обработанных фракцией, обогащенной инцистеро-лом, при аналогичных концентрациях обе активности препарата отсутствуют. 
2. В условиях предобработки клеток глутаровым альдегидом фракция, обогащенная инцистеролом в концентрации 200 и 500 мкг/мл, в отличие от не обработанных глутаровым альдегидом клеток, приводит к массовой гибели популяции, сопровождающейся появлением большого количества некротических клеток.
На основании проведенных экспериментов и данных ранее опубликованной работы (Amchenkova et al., 1998), можно заключить, что низкие концентрации глутарового альдегида в клетках СПЭВ и HeLa блокируют активность клеточных рецепторов, относящихся к группе ионных каналов. Судя по полученным в цитированной работе данным, одной из первых мишеней глутарового альдегида являются рецепторы кальциевых каналов, блокирование которых препятствует активному транспорту кальция через плазмалемму. Ясно, что это не исключает действия фракции, обогащенной инцистеролом, на другие типы клеточных рецепторов.
В опытах с клетками, мембраны которых модифицированы глутаровым альдегидом, ответ клеток зависит от использованной концентрации фракции, обогащенной инцистеролом. При концен-трации 50 мкг/мл фракция, обогащенная инцистеролом, проявляет митотстатический эффект и при этом снижает количество апоптозов. При концентрации 100 мкг/мл фракция, обогащенная инцистеролом, сильно увеличивает количество апоптозов, но не оказывает митостатического эффекта.
Одно из возможных объяснений такого концентрационно-зависимого эффекта - наличие двух различных мишеней (клеточных рецепторов) для рекрутирования фракции, обогащенной инцистеролом, в частности, рецепторов группы TNF. Проверка этой гипотезы требует проведения дополнительных исследований. В любом случае, наблюдаемые эффекты, по-видимому, опосредованы негеномными механизмами.
Известно, что к числу патологий, индуцированных нарушением транспорта Ca2+, относятся гипертония и сердечная недоста-точность. Ранее в наших экспериментах на модели крыс линии HSR было показано, что экстракт мицелия вешенки обладает выраженным антигипертензивным действием (статья в настоящем сборнике), что может быть опосредовано участием фракции, обогащенной инцистеролом,   как лиганда для рецепторов ионных каналов.

  Список литературы:
1. Изучение и установление механизма действия «Экстракта мицелия вешенки «Оводорин»: отчет о НИР / Поляков В.Ю., Кирьянов Г.И. – М.: ООО ИЛЦ «Универсал», 2009. - 49 с.
2. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotusostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток/ В.Ю. Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Журнал «Биологические мембраны».  – 2007. –Том 24. №5. -С. 379-388.