ИНБИОФАРМ

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ СОСТАВА ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА И ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИЯ

В.Н. Ташлицкий, Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, *С.В.Захаров, *В.П. Герасименя.
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Необходимость дополнительного выделения из состава сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 активного вещества обоснована, прежде всего, его очень малым природным содержанием в экстракте мицелия, колеблющимся, в зависимости от сезона культивирования мицелия, от 1,0 мг до 5,0 мг (от 0,001% до 0,005%) в 100,0 г экстракта, что явно недостаточно для проявления его полифункциональной медико-биологической активности в рекомендуемых для применения дозах экстракта в виде геля или сиропа (от 100 мг/кг до 200 мг/кг) [1] .
Проведенные нами лабораторные испытания медико-биологической активности очищенного вещества на крысах показали, что эффективная суточная доза его применения составляет 1,0 - 2,0 мкг [2] .
Следовательно, если применять разработанный препарат без дополнительного обогащения фармакологической субстанции актив-ным веществом, то не будет достигнут необходимый лечебный эффект при его применении в качестве препарата «сопровождения» химиотерапии [3].
Для получения из сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 содержащегося в нем активного вещества и установления структуры этой молекулы, была разработана технология его выделения из 2000,0 г экстракта в виде геля [4], полученного из мицелия Pleurotus ostreatus 1137, культивируемого по разработанной нами технологии [5].
Для получения активного начала его обогащение из сгущен-ного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 производили экстракцией хлористым метиленом следующим образом:
100 г препарата суспендировали в 500 мл дистиллированной воды, доводили при необходимости рН до 1,7 – 1,9 с помощью 1н H2SO4. Раствор центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин. Осадок и флотирующие компоненты отбрасывали. Раствор переносили в стеклянную колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена и встряхивали на качалке 45 минут при комнатной температуре. Смесь разделяли при помощи центрифугирования (30 мин при 3000 об/мин), отбирали нижнюю (органический растворитель) фазу. Водную фазу экстрагировали повторно: переносили в колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена, встряхивали на качалке и центрифугировали. Экстракты объединяли и упаривали на роторном испарителе без нагревания. Сухой остаток в колбе растворяли в 10 мл дистиллированной воды, переносили в стеклянные флаконы вместимостью 10 мл (по 1 мл на флакон), замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение ночи.
Обогащенный с помощью хлористого метилена экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде сухого остатка (100-200 мг) растворяли в 96% этаноле до концентрации 100 мг/мл. Полученный раствор (аликвоты по 400 мкл) разделяли хроматографически на полупрепаративной ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делителя потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы. Была использована полупрепаративная колонка 24*250мм с сорбентом Диасорб С16Т (10 мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол / 0.1% трифторуксусная кислота в воде 60:40, при скорости потока 10 мл/мин и температуре 300С. Время анализа - 40 мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали, добавляли 30% раствор аммиака до нейтрального значения рН 5-6 и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем хлористого метилена, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке.
Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания и растворяли в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100 мкл) дополнительно разделяли с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation. Была использована аналитическая колонка 4,6*250мм с сорбентом Luna С 18(2) (5 мкм). Состав подвижной фазы: ацетонитрил / вода 79:21, при скорости потока 1 мл/мин и температуре 250С. Время анализа - 21 мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 15-18 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем хлористого метилена, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке. Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания, растворяли в 1 мл хлористого метилена и сушили в эксикаторе. Для наработки требуемого количества активного вещества технологический процесс многократно повторяли.
Общий выход вещества 4-hydroxy-17R-methylincisterol составил 10 мг.
Хроматограмма препарата, обогащенного дополнительной экстракцией хлористым метиленом, на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*150 мм (подвижная фаза: ацетонитрил / вода / 1% ТФУ в воде=79:16:5, скорость потока 1,5 мл/мин при 250С, детекция при 230 нм, время удерживания интересующего вещества 6 - 7 мин, время анализа 13 мин), приведена на рисунке 1.
Пример полупрепаративного разделения фракции (после препаративного ВЭЖХ) с использованием аналитической ВЭЖХ-системы на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм (подвижная фаза: ацетонитрил / вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 250С, УФ-детекция при 230 нм) приведен на рисунке 2 (время удерживания вещества 16 мин).
Хроматограмма очищенного вещества на аналитической колонке Luna C18(2) (5мкм) 4,6*250 мм (подвижная фаза: ацетонитрил/вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 250С, детекция при 230 нм) приведена на рисунке 3.
Молекулярный вес вещества был оценен методом UPLC/MS с использованием квадрупольного масс-спектрометра и электро-спрей-ионизации. Молекулярная формула C21H32O3 была определена по точной массе методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF) с электроспрей-ионизацией. Результаты определения молекулярного веса и брутто-формулы приведены на рисунках 4, 5, 6.
На рисунке 4 приведен масс-спектр в режиме регистрации позитивных ионов:
пик 356 представляет собой ион М+Na+(333+23(Na+)=356),
пик 688 - это ион 2М+Na+(332.5*2+23=688.),
пик 1021 - ион 3М+Na+(332.7*3+23=1021).
На рисунке 5 приведен масс-спектр в режиме регистрации негативных ионов: пик 331.38 соответствует молекулярному иону М-Н- (масса 332.38), пик 663.97 является ионом 2М-Н- (332.5*2-1=664), пик 996 – ион 3М-Н- (332.33*3 -1=996), пик 1328 - ион 4М-Н- (332.25*4 -1=1328).
Таким образом, молекулярный вес составляет 332.25 - 333 ем.
На рисунке 6 приведено определение точной массы, которое проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF).
355.2295 = С21 Н32 О3 Na+ (15ppm);
333.2452 = С21 НЗЗ О3+ (8ppm).
Проведенные с помощью программы Structure Elucida-tor/ACDlabs (Канада) исследования позволили установить структуру вещества.
ЯМР спектр 13C содержит 21 сигнал атомов углерода. Число протонов, присоединенных к каждому атому, было определено комбинированием спектров 13C, 1H, APT и HMQC. Химические сдвиги и мультипликативность углеродных сигналов приведены в таблице 1.
Структура определялась комбинированием 13C, APT, HMQC, HMBC и COSY данных. Для определения относительной конфигурации оптически активных центров был использован спектр ROESY.
Программа генерирует набор структур, которые соответствуют исходным данным по химическим сдвигам и 2D корреляциям.
Спектр COSY содержит 27 однозначных корреляций, которые показаны на предложенной структуре в виде прерывистой линии (рисунок 7). Практически все теоретически возможные корреляции COSY присутствуют в спектре. Только корреляции между двумя парами атомов не были найдены в спектре - в основном из-за маскировки другими корреляциями с близким химическим сдвигом. Например, корреляция между атомами 8 и 12 (1.49 - 1.88 ppm) очень близка по химическому сдвигу к корреляции между двумя протонами, присоединенными к атому 7 (1.48 - 1.92). Корреляция между атомами 7 и 15 (1.48 - 1.50 ppm) слишком близка к интенсивным диаго-нальным пикам. Дополнительно на спектре присутствует одна корреляция между атомами 14 и 17, показанная на рисунке 7 в виде прерывистой линии с точками. Информация, полученная из спектра COSY, позволила однозначно установить скелет молекулы.
Циклическая часть молекулы содержит несколько четвертичных атомов углерода, которые не могут быть установлены с помощью спектра COSY. Поэтому для определения этой части молекулы использован спектр HMBC. Спектр HMBC содержит 85 корреляций (рисунок 8 и таблица 1). Все теоретически возможные корреляции (2J и 3J) были найдены в спектре HMBC. Дополнительно 4 дальнодействующие корреляции (4J) присутствуют в спектре. Эти корреляции выделены на рисунке 8 в виде прерывистой линии с точками.
Установленная структура имеет самое лучшее соответствие с углеродным спектром (среднее отклонение между рассчитанными и экспериментальными значениями составляет 2.6 ppm).
Все вышесказанное позволяет утверждать, что структура препарата установлена однозначно.
Определение стереоконфигурации
Е-конфигурация двойной связи была определена на основании константы спин-спинового взаимодействия (15.1 Hz). Для опреде-ления относительной стереоконфигурации четырех стереоцентров циклической системы использовался спектр ROESY. Два стереоцентра в боковой цепи не рассматривались (из-за наличия свободного вращения). Для всех возможных 16 (24) стереоизомеров были рассчитаны расстояния между атомами и сравнены с соответствующими дистанциями, определенными из объемов пиков спектра ROESY. Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера приведена на рисунках 9, 10.
На рисунке 9 стереоцентры с неопределенной конфигурацией отмечены звездочкой.
На рисунке 10 показана 3D модель структуры с ключевыми корреляциями NOE.
Следует учесть, что описанный метод пригоден только для определения относительной стереоконфигурации и соединение может иметь зеркальную стереоконфигурацию. Тем не менее, данная конфигурация является предпочтительной, т.к. в общих частях совпадает с конфигурацией известных природных соеди-нений.
Химические сдвиги 1H вещества показаны на рисунке 11.
Химические сдвиги 13C вещества показаны на рисунке 12.
На основании полученных результатов   исследований нами было установлено, что выделенное из первичного экстракта вещество - производное стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol  (инцистерол) является принципиально новым веществом, ранее не описанным для известных медицинских грибов.
В мировой литературе есть сообщение об обнаружении такого аналога стерола в морских губках [6].

Описание: Безимени-3
Рисунок 1 - Хроматограмма исходного раствора (анализ экстракта обогащенного повторной экстракцией хлористым метиленом на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*150 мм.

Описание: Безимени-4
Рисунок 2 - Повторное выделение целевого вещества на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм после полупрепаративного ВЭЖХ.
Описание: Безимени-5
Рисунок 3 - Хроматограмма очищенного вещества производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol (аликвота 10мкл: ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C18(2) (5мкм) 4,6*250 мм
Описание: Безимени-6
Рисунок 4 - Результаты определения молекулярного веса методом UPLC/MS в режиме регистрации позитивных ионов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
Описание: Безимени-003
Рисунок 5 - Результаты определения молекулярного веса методом UPLC/MS в режиме регистрации негативных ионов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
Описание: Безимени-2
Рисунок 6 - Результаты определения точного молекулярного веса и брутто-формулы методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF) производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.

$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 1 Инцестерол.tif$
Рисунок 7 - Однозначные корреляции предполагаемой структуры, найденные в спектре COSY.

$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 1 Инцестерол.tif$
Рисунок 8 - Корреляции спектра HMBC , соответствующие предполагаемой структуре.
$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 1 Инцестерол.tif$
Рисунок 9 - Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterolна основании спектра ROESY.
$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 2 Инцестерол.tif$
Рисунок 10 - 3D модель структуры 4-hydroxy-17R-methylincisterol с ключевыми корреляциями NOE .
$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 2 Инцестерол.tif$
Рисунок 11 - Химические сдвиги 1H производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
$Описание: C:\Users\Валерий\Desktop\Рис 2 Инцестерол.tif$
Рисунок 12 - Химические сдвиги 13C производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol .

Таблица 1 - Химические сдвиги и мультипликативность углеродных сигналов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol

Atom	C Shift	H Shift	XHn	COSY	H HMBC	C HMBC
1	11.74	0.62	CH3		1.52, 1.65, 1.99, 2.67	48.85, 50.37, 55.34, 35.06
2	17.61	0.94	CH3	1.88	1.49, 1.88, 5.27	42.84, 33.05, 132.85
3	19.65	0.84	CH3	1.49	0.86	19.97, 33.05, 42.84
4	19.97	0.86	CH3	1.49	0.84, 1.49, 1.88	42.84, 19.65, 33.05
5	21.03	1.06	CH3	2.07	2.07, 5.19	134.66, 40.13, 55.34
6	21.38	1.52	CH2	2.67, 1.92, 1.74	2.67	28.86, 11.74, 48.85, 50.37, 35.06, 40.13, 170.75
6	21.38	1.74	CH2	2.67, 1.92, 1.52	2.67	55.34, 48.85, 50.37, 28.86
7	28.86	1.48	CH2	1.92	1.52, 1.65, 1.74	55.34, 40.13, 50.37
7	28.86	1.92	CH2	1.74, 1.52, 1.48	1.52, 1.65, 1.74	48.85, 55.34
8	33.05	1.49	CH	0.86, 0.84	0.84, 0.86, 0.94, 1.88, 5.27	17.61, 42.84, 19.97, 132.85
9	35.06	1.65	CH2	2.31, 1.99, 1.88	0.62, 1.52, 1.88, 2.31, 2.67	48.85, 50.37, 55.34, 11.74, 28.86, 35.25, 105.00
9	35.06	1.99	CH2	2.31, 1.65, 1.88	0.62, 1.52, 1.88, 2.31, 2.67	48.85, 50.37, 11.74, 35.25, 105.00
10	35.25	1.88	CH2	2.31, 1.65, 1.99	1.65, 1.99	105.00, 35.06
10	35.25	2.31	CH2	1.99, 1.88, 1.65	1.65, 1.99	48.85, 105.00, 170.75, 35.06
11	40.13	2.07	CH	1.50, 1.06, 5.19	1.06, 1.48, 1.52, 5.19, 5.27	21.03, 55.34, 132.85, 134.66
12	42.84	1.88	CH	0.94, 5.27	0.84, 0.86, 0.94, 1.49, 5.19, 5.27	132.85, 134.66, 17.61, 19.97, 33.05
13	48.85		C		0.62, 1.50, 1.52, 1.65, 1.74, 1.92, 1.99, 2.31, 2.67
14	50.37	2.67	CH	1.74, 1.52, 5.65	0.62, 1.48, 1.52, 1.65, 1.74, 1.99, 5.65	21.38, 112.22, 170.75, 11.74, 35.06, 48.85, 55.34, 105.00
15	55.34	1.50	CH	2.07	0.62, 1.06, 1.48, 1.65, 1.74, 1.92, 2.07, 2.67, 5.19	48.85
16	105.00		C		1.65, 1.88, 1.99, 2.31, 2.67, 5.65
17	112.22	5.65	CH	2.67	2.67	105.00, 50.37, 171.19, 170.75
18	132.85	5.27	CH	5.19, 1.88	0.94, 1.49, 1.88, 2.07, 5.19	17.61, 33.05, 134.66, 40.13, 42.84
19	134.66	5.19	CH	5.27, 2.07	1.06, 1.88, 2.07, 5.27	21.03, 132.85, 40.13, 42.84, 55.34
20	170.75		C		1.52, 2.31, 2.67, 5.65
21	171.19		C		5.65

Список литературы:
1. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю. Препарат с полифункциональной медико-биологической активностью, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-819 для его получения». Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Бюл. № 20 от 20.07.2013 г.
2. Гиполипидемическая активность составляющих веществ препарата «Гиповодин» на основе биологически активных веществ «Экстракта мицелия вешенки «Оводорин», разработанного ООО «Инбиофарм», г. Москва: отчет о НИР / Перова Н.В. -М.: АНО «ИМБИИТ», 2009. - 25 с.
3. Экспериментальное исследование in vivo противоопухолевой активно-сти препаратов выделенных из мицелия грибов Pleurotus ostereatus : отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 29 с.
4. Герасименя В.П., Захаров С.В. Кирьянов Г.И., Ташлицкий В.Н. Препарат 4-hydroхy- 17R- methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения. Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.06.2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.
5. Герасименя В.П. Инструкция описания технологического процесса культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и получения из него экстракта биологически активных веществ: инструкция / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П. Семашева – М.: ООО «Инбиофарм», 2008. – 39 с.
6. Tayyab A. Mansoor, Jongki Hong, Chong-O. Lee, Song-Ja Bae, Kwang Sik Im, Jee H. Jung Cytotoxic Sterol Derivatives from a Marine Sponge Homaxinella sp. J. Nat. Prod. 2005, 68, 331-336.