ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ
Pleurotusostreatus 1137 (ВКПМ, F–819)

 Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, В.Н. Ташлицкий, В.А. Носков,
Л.Н. Кинцурашвили, *С.В. Захаров, *В.П. Герасименя.
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского  Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;
 *ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Введение
Базидиомицеты относится к обширной группе «медицинских» грибов, которые  используются в восточной медицине для профилактики и лечения  многих тяжелых заболеваний, таких как бактериальные и вирусные инфекции, ВИЧ, диабет, гипер-холестеролемия, сердечно-сосудистые патологии, лейкозы и  онкологические заболевания. Это удивительное многообразие эффектов медицинских грибов привлекает пристальное внимание различных областей медицины, биохимии и молекулярной биологии.
В настоящее время из плодовых тел или культивируемого мицелия базидиомицетов выделены и охарактеризованы вещества, обладающие специфической биологической активностью. В современной медицинской практике широко используются статины, полисахариды, β- глюканы и ганадермовые кислоты. На их основе созданы такие лекарственные препараты, как бефунгин (Россия) и лентанан (Япония), полученные из плодовых тел Lentinus edodes и   Inonotus obliguus, сонифилан и шизофиллан (Япония),  полученные из культуральной жидкости  Schizophyllum commune (Mizuno 1996, Miles, Chang, 1997).
На основе экстрактов мицелия созданы биологически активные добавки «Мипро-ВИТ» (Патент РФ 2092179, 1997); БАД к пище из грибов Fusarium sambucinum Fuskel var. ossicolum (berk. Etcurf) bilai (РФ) (Патент РФ 2040932, 1993); БАД к пище «Микотин» (Украина), (Горовой, Сенюк, Трутнева, 1997) и др.
При этом, судя по работам зарубежных и отечественных исследователей, потенциал базидиомицетов, как продуцентов новых лекарств, далеко не исчерпан [1-6].
Цель настоящей работы - получение из экстракта мицелия Pleurotusostreatus  ранее не идентифицированных химически чистых веществ, обладающих выраженной биологической активностью.
Как показывает анализ литературы, на практике применяются два противоположных подхода к выделению из мицелия  базидиомицетов биологически активных веществ:  экстрагирование в водных средах или органических растворителях. В первом варианте в экстракт переходят полимерные вещества - белки и полисахариды (β - глюканы), во втором - различные низкомолеку-лярные соединения, часть которых идентифицирована. Это эргостерины,  никотиновая кислота, полифенолы, эллаготанины и гидролизуемые  танины, а  также антиоксиданты.  Некоторые из них обладают антираковой активностью, заключающейся либо в прямом цитотоксическом   действии на клетки опухоли за счёт индукции апоптоза, либо действуют опосредованно, путём стимуляции противоракового иммунитета.
Работа планировалась и осуществлялась  в соответствии с алгоритмом, принятым для  биотехнологических методов  создания лекарственных препаратов.

Результаты и обсуждение
В качестве продуцента биологически активных веществ в работе использовался штамм Pleurotusostreatus №1137, ВКПМ, F - 819, один из 14 штаммов, выделенных в чистую культуру под руководством проф. О.В. Камзолкиной (МГУ). Критерием отбора послужила наиболее выраженная антимикробная активность этого штамма.
Мицелии Pleurotusostreatus 1137 (ВКПМ, F – 819) выращивали в регулируемых асептических условиях методом жидкофазного глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей растительное сырье [7,8].
После культивирования отжатый от культурной среды мицелий экстрагировали этанолом, подкисленным до рН 2-3 в течение 18-20 часов. Очистку экстракта от фрагментов мицелия проводили фильтрованием, полученный экстракт упаривали в вакууме при температуре 40-500С до вязкого однородного гелеобразного состояния с содержанием воды до 30 %  [7].
Полномасштабный скрининг экстракта, направленный на выявление его биологической активности в системе invitro(на культивируемых клетках) и invivo, на модели экспериментальных животных
На этом этапе проявились достаточно неожиданные свойства экстракта (см. статью в настоящем сборнике).
Во-первых, сочетанное использование экстракта и медицин-ских цитостатиков (циклофосфана, доксорубицина и 5-азацитидина) показывает ярко выраженный синергизм, который в зависимости от концентрации реагентов и способа их инсталляции выражается в подавлении пролиферации и в индукции апоптоза. Этот эффект зарегистрирован на клетках  HeLa и на клетках миелоидного лейкоза, т. е. на моделях клеток как эпителиального, так и мезенхимного происхождения (см. статью в настоящем сборнике).
Во-вторых, испытания    invivo, на модели экспериментальных животных, выявили полифункциональность экстракта: он нормализует липидный обмен, оказывает антигипертензивное действие и ингибирует развитие опухолевого роста (см. статью в настоящем сборнике).
Как известно, аналогичным спектром активностей обладают статины. С химической точки зрения группа статинов неоднородна и представлена совершенно неблизкими соединениями. Наиболее используемыми в фармакологии статинами являются производные стеролов, продуцируемые низшими грибами из рода  Aspergillus, например, ловастатин, полусинтетические модификации которого выпускаются под десятками названий в качестве эффективных антигиперлипидемических средств. Эти препараты, в частности Зокор, уменьшают риск инсультов и формирования склеротических бляшек за счет снижения содержания холестерина и оптимизации соотношения липопротеидов низкой и высокой плотности. 
Активными исследованиями действия ловастатина выявлена одна из, по-видимому, главных мишеней его действия.  
Показано, что ловастатин (и, возможно, ряд других статинов) является ингибитором одного из ферментов синтеза холестерина из мевалоната, а именно 3-гидрокси-3-метил-глутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). В то же время ясно, что мишеней для действия статинов  может быть и больше в соответствии с этапами синтеза и метаболизма холестерина.
В последнее время опубликованы чрезвычайно интригующие данные о том, что статины обладают онкопротекторными свойст-вами, при этом механизмы таких эффектов остаются неизвестными.
На основании перечисленных данных возникло предположение, что действующим началом экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) являются вещества, относящиеся к классу статинов. В частности, на такую возможность  указывают данные, по которым один из представителей статинов (ловастатин) обнаружен в вешенке (Alberts et.al., 1989; Gunde-Cimerman et. al., 1995).
Однако, тщательный химический анализ ЭМВ с исполь-зованием ВЭЖХ/МС не выявил в экстракте наличие статинов стероидной природы. В связи с этим настоятельной стала задача выявления активного вещества и идентификация его химической природы.
Для этого было использовано фракционирование ЭМВ  с  помо-щью HPLC. В результате фракционирования материал ЭМВ функционально разнороден. Получены фракции, обладающие ярко выраженным эффектом индукции апоптоза, максимальная доля апоптических клеток в ряде случаев в 10-30 раз превышает контрольные значения. В то же время некоторые фракции HPLC  обладают митотическим эффектом  (рисунки  1 и 2).

Графики01.jpg
Рисунок 1 - Действие фракций экстракта мицелия  вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

Графики02.jpg

Рисунок 2 - Действие фракций экстракта мицелия  вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

Как и в случае исходного нефракционированного экстракта, полученная фракция не оказывает апоптогенного и митостати-ческого действия на нормальные фибробласты.
В последующих экспериментах были предприняты попытки разделить материал экстракта с помощью различных раство-рителей.
Одним из таких подходов было переосаждение материала фракций этанолом при подкислении. Биологические испытания полученных таким образом минимально очищенных фракций не показали существенного эффекта.
В дальнейшем была избрана стратегия, ранее хорошо оправдавшая себя на практике. Были подобраны органические растворители, образующие двухфазную систему с этанолом (т. е. с раствором материала фракции). Кроме того, эти растворители испытывали в двух областях рН - кислой (рН 1,7) и щелочной (рН 11,0).
Первые же результаты этих экспериментов были обнаде-живающими. На рисунке 3 представлена оценка влияния субфрак-ций на митотический и апоптотический индексы. Отметим два момента. Испытывали биологическое действие материала, перешедшего из этанольного суммарного экстракта в растворители. Во всех случаях оценивали количество материала (весовое), перешедшее в растворитель. В среднем разные растворители (при разных значениях рН) экстрагировали из суммарного экстракта от 2 до 5% материала.
Таким образом, условная степень очистки была 20…50- кратной. В опыты по биоиспытанию эти субфракции экстракта брали в концентрации, соответствующей концентрациям их в суммарном экстракте, что позволило сопоставить биологический эффект отдельных субфракций и суммарного экстракта. Из результатов отметим самые интересные:
1. Гексан при рН 1,7 экстрагирует «апоптотически активные» вещества, эффект по сравнению с суммарным экстрактом в 3 - 4 раза выше. Одновременно в этой фракции снижается количество «митотически активных» веществ.
2. Тот же гексан при рН 11,0 экстрагирует «митотически активные» вещества. Таким образом, при этом подходе становится реальной задача фракционирования двух разных активностей.
3. В экстракте хлористым метиленом резко обогащается количество «апоптотически активных» веществ вне зависимости от рН. Обогащение по активности составляет от 2 до 10  раз по сравнению с суммарным экстрактом. Наиболее ярким был эффект при рН 1,7  (рисунок 3).

Графики03.jpg
Рисунок 3 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

В следующих экспериментах были выбраны 2 растворителя, наиболее эффективно экстрагирующие «апоптотическую актив-ность» - хлористый метилен (рН 1,7) и эфир (рН 11,0). Был обнаружен факт стимуляции апоптоза материалом фракции хлористого метилена в опыте без обработки клеток циклофосфаном (рисунок 4).

Графики04.jpg
Рисунок 4 - Действие фракций экстракта мицелия  вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

Более того, циклофосфан при некоторых концентрациях материала фракции снижал «апоптотический эффект»  (рисунок 5).
Эффект «эфирной» фракции был меньше. Такие же результаты получены для бутанола.

Графики05.jpg
Рисунок 5 - Действие фракций экстракта мицелия  вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

В следующем эксперименте была поставлена задача проверки эффекта «апоптотического действия» материала фракции без сочетания с циклофосфаном. Кроме того, мы попытались выявить наличие дозовой зависимости эффекта (рисунок 6). В этом опыте была выявлена линейная зависимость «апоптотического действия» от дозы фракции.

Графики06.jpg
Рисунок 6 - Действие фракций экстракта мицелия  вешенки  (ЭМВ) на клетки  HeLa.

Суммируя этот этап работы, можно заключить, что оптимальным способом экстракции «апоптотически активного» начала следует считать хлористый метилен (рН 1,7). Этот прием дает наиболее воспроизводимые результаты, выраженную дозовую зависимость, технологичность процедур. При этом очистка активного начала составляет от 20 до 50 раз.
В дальнейшем именно эта фракция была использована для выделения и идентификации действующего начала (основного) с помощью ВЭЖХ. Схема выделения приводится ниже. Выход этого вещества - инцистерола составляет в среднем около 2 мг на 1 грамм фракции хлористого метилена (~0.1%).

Выделение активного вещества из экстракта хлористым метиленом
Экстракт хлористым метиленом (1г) растворяется в 96% этанолом в концентрации 100 мг/мл. Полученный раствор (аликвоты по 400мкл) разделяем хроматографический на полупрепаративной ВЭЖХ - системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500мкл, колоночного термостата и делительного потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы. Была использована полупрепаративная колонка 24*250мм с сорбентом Диасорб С 16Т (10мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол/0.1%ТФУ в воде=60:40, при скорости потока 10мл/мин и температуре 300С. Возможно использование аналогичной хромато-графической системы и аналогичной обращено-фазной колонки.
Время анализа - 40 мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают, добавляют 30% раствор аммиака до нейтрального значения рН 6-8 и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена, экстра-гируют и органический слой отделяют на делительной воронке.
Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания и растворяют в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100мкл) разделяют с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation. Была использована аналитическая колонка 4,6*250мм с сорбентом Luna C18(2) (5мкл). Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращено-фазной колонки. Состав подвижной фазы: ацетонитрил/вода=79:21, при скорости потока 1мл/мин и температуре 250С. Время анализа - 21 мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 15 - 18мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке. Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания, растворяют в 1мл хлористого метилена и сушат в эксикаторе. Выход составляет около 2мг.

Список литературы:
1. Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами: обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3, 1999  p. 31-62. 
2. Корсун В.Ф.   Противоопухолевые  свойства грибов / В.Ф.Корсун, Л.М. Краснопольская, Е.В. Корсун, М.А. Авхукова.  –М.: «Мэйлер»,2012. -210 с.
3. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов / Е.П.  Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология  -1998, т.34,- № 6, -С. 597-608.
4. Герасименя В.П. Роль и значение нового полифункционального препарата «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в сопровождении комплексной терапии онкологических заболеваний: аналитический обзор / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков.   -М.: ООО «Инбиофарм», 2010. – 33с.
5. Герасименя В.П. Результаты экспериментальных (доклинических) исследований о противоопухолевой активности экстракта мицелия гриба «вешенка обыкновенная» и его способности потенцировать антибластомное действие цитостатических препа-ратов.  Аналитический обзор/ В.П.Герасименя,  Т.И. Милевич,  С.В. Захаров  и др.  //  Журнал  Здравоохранение Беларуси.  -Минск.:  -2012.   -12с.
6.  V. P. Gerasimenia, S. V. Zakharov, V. Yu. Polyakov, G. I. Kirianov, K. Z. Gumargalieva, L. A. Putyrskyi, Yu. L. Putyrskyi, and T. I. Milevich . Application of a New Polyfunctional Preparation "Oyster Mushroom Mycelium Extract "Ovodorin®'" to the Correction of Drug Intolerance in the Complex Treatment of Oncological Diseases: The Overview of Cytological, Biological and Medical Results // Volume 2 Issue 1. The Overview of Cytological, Biological and Medical Results. 2012. -48s.
7. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (ТУ 9317-01-87552538-08). / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 8 с.
8. Технические условия ТУ 9317-01-87552538-08. БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН». / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 22 с.
9. (Jong, Donovick, 1990; Babineau etal. 1994b; Dellinger, E.P. et al. 1999), ганодермиевые кислоты.
10. Jong, S.C. and Donovick, R. 1990. Antitumour and antiviral substances from fungi. Advances in Applied Microbiology 34, 183-262.
11. Babineau, T.J. et al. 1994b. Randomised phase I/II trial of a macrophage-specific immunomodulator(PGG-glucan) in high-risk surgical patients. Annals of Surgery 220, 601-609.
12. Dellinger, E.P. et al. 1999. Effect of PGG-glucan on the rate of serious postoperative infection or death observed after high-risk gastrointestinal operation. Betafactin Gastrointestinal Study. Archives of Surgery 13, 977-983
14. Hirotani, M. and Ito, C. 1986. Ganoderic acids T, S and R, new triterpenoids from the culturedmycelia of Ganoderma lucidum. Chemical Pharmaceutical Bulletin 34, 2282-2285.
15. Chen, Y. and Zhou, M. 1997. Damage to macrophages by tetrabutyl hydroperoxide and the protective actions of the protein-bound polysaccharide Krestin. Medical Science Research 25, 606-609.
16. Mizuno, T. 1995. Bioactive biomolecules of mushrooms: food function and medicinal effect of mushroom fungi. Food Reviews International 11, 7-21.
17. Li, M. and Lei, L.S. 2000. Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on oxygen-free radicals in murine peritoneal macrophages. Zhongguo Yadikxue Yu Dulixue Zazhi – Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology 14, 65-68.
18. Sheng, J.H. and Chen, Q.H. 1989. Antilipemic effect of polysaccharides from Auricularia aurantia, Tremella fuciformis and T. fuciformis spores. Journal of China Pharmaceutical University 20, 344-347.
19. Koichi, A. and Takahiro, I. 1999. Antihypercholesterolemic agent, hypocholesterolemic agent and agent for preventing and treating arteriosclerosis. JP Patent No. 11193244 published 21.07.1999.
20. Susuki, S. and Ohshima, S. 1974. Influence of shiitake Lentinus edodes on human serum cholesterol. Annual Report of National Institute of Nutrition 25, 89-94.
21. Alberts, A.W., MacDonald, J.S., Till, A.E. and Tobert, J.A. 1989. Lovastatin. Cardiovascular DrugReviews 7, 89-109.
22. Gunde-Cimerman, N. and Cimerman, A. 1995. Pleurotus fruiting-bodies contain the inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase-lovastatin. ExperimentalMycology19, 1-6.