ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО И ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137  НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА,
 В КЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ in vitro

Климова  Р.Р.,  Чичев Е.В.,  *Захаров С.В.,  *Герасименя В.П.,  Кущ А.А.

 ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», Минздрава России, Москва;
 * ООО «Инбиофарм», Россия, Москва.

Введение
Вирус простого герпеса (ВПГ) чрезвычайно широко распрос-транен в человеческой популяции и может поражать различные органы и ткани. У лиц со сниженным иммунитетом герпесвирусные инфекции часто приводят к тяжелым осложнениям, нередко - со смертельным исходом. Особую опасность ВПГ-инфекция представ-ляет для беременных женщин и для новорожденных детей. В настоящее время существует несколько патентованных лекарст-венных препаратов, применяемых при лечении герпесвирусных инфекций, однако большинство из них не разрешены для лечения беременных женщин и новорожденных детей. Основными недостатками химиопрепаратов являются их высокая токсичность, ограниченная биодоступность и при длительном использовании - развитие лекарственной устойчивости  [1-7]. В связи с этим в настоящее время проводится поиск новых средств и новых схем терапии, позволяющих избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности.
Цель работы состояла в изучении действия  экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (препарата ЭМВ)  на клетки культуры, а также способности подавлять инфекционную активность вируса простого герпеса (ВПГ) при разных схемах его введения, в том числе в сочетании с противоопухолевыми препаратами доксорубицином и циклофосфаном.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить цитотоксические свойства препарата ЭМВ in vitro;
-  провести анализ действия препарата ЭМВ на ВПГ-инфекцию при однократном введении  препарата в клеточную культуру;
-  сравнить противовирусный эффект препарата ЭМВ при однократном и при повторном (двукратном) внесении в культуру клеток;
- изучить цитотоксическое действие доксорубицина и циклофосфана на клетки культуры;
- определить противовирусные свойства препарата ЭМВ при сочетанном действии с доксорубицином и циклофосфаном.

Материалы и методы
Клетки 
В экспериментах использовали монослойную культуру клеток почек зеленой мартышки перевиваемой линии Vero, полученных  из коллекции клеточных культур ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Клетки Veroне проявляют онкогенных свойств и не образуют злокачественные опухоли при введении животным. Клетки выращивали в минимальной среде Игла (ПанЭко, Россия), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коровы (ЭТС) (ПанЭко, Россия), 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.
Репродукция вируса
Для получения необходимого количества вируса использовали референс штамм F ВПГ типа 1, любезно предоставленный проф.Л.Перейра (L.Pereira), США. Вирус поддерживали путем пассирования, используя культуру клеток Vero. Инфекционная множественность (ИМ) инокулята составляла 0,01 бляшко-образующих единиц на 1 мл (БОЕ/мл). Вирус вносили в культуральные флаконы объемом 250 мл (Costar, США). Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа при 370С. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла с 2% ЭТС. Клетки инкубировали при 370С до выявления морфологических признаков цитопатогенного действия (ЦПД). Сбор культуральной жидкости проводили при обнаружении признаков ЦПД в 90% клеток (в среднем, через 72 часа). Все этапы культивирования проводили в CO2-инкубаторе (Sanyo, Япония) при 370С в атмосфере, содержащей 5% CO2.
Получение вируссодержащей культуральной жидкости
Культуральную жидкость, собранную от зараженных клеток и содержащую ВПГ1, освобождали от крупных клеточных фрагментов путем центрифугирования при 2000 об/мин. в течение 10-15 мин., используя центрифугу MR1812 (Jouan, Франция). Отбирали пробу надосадочной культуральной жидкости и определяли инфекционную активность содержащегося в ней вируса как описано ниже.
Определение инфекционной активности ВПГ
Инфекционную активность ВПГ1 определяли в культуре клеток Veroмодифицированным методом бляшек. Об активности судили по последнему разведению (титру) вируса, при котором наблюдали вирусспецифические бляшки - очаги инфицированных клеток, образующих группы увеличенных в размерах слившихся клеток - поликариоцитов. Для титрования готовили возрастающие десяти-кратные разведения вируса, суспензии вносили на монослой клеток Vero по 0,2 мл в 24-х луночные планшеты (Costar, США), в которые за 24 часа до этого высаживали клетки культуры. Панели с материалом инкубировали при 370С до появления вирусспеци-фических бляшек, в среднем, время инкубации составляло 7 дней. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл), используя формулу А=а*b/v, где А - число бляшкообразующих единиц в 1 мл; a - среднее число бляшек на одну лунку; b - разведение вируса; v - объём вносимого вирус-содержащего материала.
Исследуемый экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137  (препарат ЭМВ)
Исходное количество предоставленного препарата ЭМВ составляло 1г. Препарат разводили в ростовой среде без сыворотки до концентрации 100 мг/мл и использовали как исходную при проведении опытов.
Определение цитотоксического действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137   (препарата ЭМВ)
Для изучения цитотоксического действия препарата ЭМВ использовали 7 концентраций вещества - 50 мг/мл, 20 мг/мл, 10 мг/мл, 1 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл и 0,001 мг/мл. Данные рабочие разведения готовили в ростовой среде, содержащей 2% ЭТС. Препарат вносили в лунки 24-панелей на монослой клеток Veroи ежедневно оценивали состояние монослоя и состояние клеток. Подсчитывали количество жизнеспособных клеток в контрольных (без внесения препарата) и опытных лунках, используя тест исключения красителя с применением трипанового синего.
О цитотоксическом действии препарата ЭМВ судили по концентрации, вызывающей гибель 50% клеток на 3-и сутки после внесения препарата, определяя, таким образом, 50%-ную цито-токсическую дозу (ЦД50).
Оценка противовирусной активности экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137   (препарата ЭМВ)
Определение антивирусной активности invitro проводили в 4-х схемах: микробицидной, профилактической, терапевтической и вирулицидной. Исследования проводили в 96-луночных панелях (Costar, США), в лунки которых предварительно вносили клетки Vero и инкубировали до образования субконфлуентного монослоя. В качестве отрицательного контроля служили лунки с интактными клетками, не подвергавшимися воздействию ни препарата ни вируса; в качестве положительного контроля служили лунки с клетками, зараженными ВПГ1. Ранее нами было установлено, что при внутрибрюшинном заражении лабораторных животных с последу-ющим развитием бессимптомного носительства в их органах обнаруживается ВПГ1 в концентрации 0,0006 БОЕ/мл. В связи с этим при изучении противовирусного действия препарата ЭМВ были использованы эти концентрации вируса (0,0006 БОЕ/мл и 0,0005 БОЕ/мл) и дополнительно 2 более высокие концентрации.
Микробицидная схема (экстренная профилактика). На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую препарат в изучаемых концентрациях, и инкубировали в течение 1 часа. После обработки клетки промывали и заражали вирусом в различных разведениях ВПГ1 - 10-3, 10-4, 10-5, что соответствовало 0,06; 0,006 и 0,0006 БОЕ/мл. После инкубации в течение 1 часа при 37ºС монослой клеток промывали и вносили среду поддержки.
Профилактическая схема. В культуру клеток Vero вносили среду поддержки, содержащую препарат в иcследуемых концен-трациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки промывали и заражали вирусом, как описано выше.
Терапевтическая схема. Монослой клеток заражали ВПГ 1 в различных разведениях: 10-4, 10-5, 10-6, что соответствовало 0,05 БОЕ/мл; 0,005 БОЕ/мл и 0,0005 БОЕ/мл. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 370С клетки промывали и вносили СЛ-493 в различных концентрациях (10 мг/мл; 1мг/мл; 0,1 мг/мл; 0,01 мг/мл; 0,001 мг/мл).
Вирулицидная схема. Вирус с различной ИМ - от 0,05 БОЕ/мл до 0,0005 БОЕ/мл инкубировали совместно с препаратом в различных концентрациях в течение 1 часа при 370С. Затем инкубационную смесь наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток промывали, вносили среду поддержки, клетки инкубировали и оценивали изменение их морфологии и жизнеспособности.
Клетки инкубировали при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2, продолжительность наблюдения во всех схемах составляла 10 дней.
Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности препарата ЭМВ подавлять цитопатогенное действие ВПГ 1. Концентрацию соединения, вызывающую ингибирование вирусного ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за 50%-ную ингибирующую дозу (ИД50).

Определение противовирусной активности экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137   (препарата ЭМВ) при повторном введении препарата
Препарат ЭМВ в исследуемых концентрациях повторно вносили в культуру через двое суток после первого введения и изучали противовирусное действие в терапевтической и в вирулицидной схемах как описано выше.
Результаты  исследования
Клетки Veroзаражали ВПГ1 с ИМ 0,05; 0,005; 0,0005 БОЕ/мл. Через 1 час вносили препарат  ЭМВ. Действие препарата во всех схемах наблюдали в течение 10 дней. Антивирусную активность оценивали по стандартным тестам.  
Инфекционная активность ВПГ1
Оценка активности вируса, используемого в проведенных экспериментах, методом титрования показало, что последнее разведение вируса, при котором наблюдали формирование 1 бляшки, составило 10-7. Таким образом, инфекционный титр использованного в опытах ВПГ1 был равен 107 БОЕ/мл. В работе использовали ВПГ1 в 3-х разведениях: 10-4, 10-5 и 10-6, что соответствовало 0,05; 0,005 и 0,0005 БОЕ/мл.
Цитотоксическое действие препарата ЭМВ
Результаты изучения токсичности препарата представлены на рисунке 1. Установлено, что в концентрациях от 1 мкг/мл до 10 мг/мл препарат ЭМВ не оказывает токсического действия на клетки Vero. При концентрации 20 мг/мл наблюдалась гибель 75% клеток, при концентрации 50 мг/мл – практически всех (100%) клеток. Методом экстраполяции было установлено, что гибель 50% клеток Vero соответствует концентрации препарата 16,7 мг/мл  (рисунок 1). Таким образом, ЦД50 для препарата ЭМВ составляет 16,7 мг/мл.


Рисунок 1 - Определение ЦД-50 для препарата ЭМВ на культуре клеток Vero.

Противовирусная активность препарата ЭМВ
Изучение влияния препарата ЭМВ на противовирусную активность в отношении ВПГ1 в клеточной системе in vitro показало, что препарат в изученных концентрациях не обладает микро-бицидными и профилактическими свойствами при использовании как высоких, так и низких концентраций вируса.
Для изучения терапевтических свойств препарата на монослой клеток Vero вносили ВПГ1 с различной ИМ и инкубировали в течение 1 часа. Затем клетки промывали и вносили среду поддержки, содержащую препарат ЭМВ в исследуемых концентрациях (10 мг/мл, 1мг/мл, 0,1мг/мл, 0,01мг/мл и 0,001 мг/мл).
Было показано, что при заражении вирусом с ИМ 0,05 и 0,005 БОЕ/мл 100%  вирусспецифическое ЦПД наблюдается через 2-3 суток как в контроле (без препарата ЭМВ), так и в опыте (при всех использованных концентрациях препарата ЭМВ).
Результаты изучения действия препарата ЭМВ (партия СЛ-493) при снижении инфекционной дозы вируса показаны на рисунке 2.

Рисунок 2 - Противовирусная активность  препарата ЭМВ (партия СЛ - 493) при заражении клеток Vero c с инфекционной множественностью 0,0005 БОЕ/кл.
В контроле при заражении ВПГ1 с ИМ 0,0005 БОЕ/мл на 3 сутки наблюдали ЦПД, затрагивающее 30% клеток. В опыте, при внесении препарата ЭМВ в концентрации 10 мг/мл, вирус-специфичес-кое ЦПД было минимальным. Данные на рисунке 2 показывают, что обработка клеток препаратом ЭМВ в концентрации 10 мг/мл задерживает развитие вирусного ЦПД в культуре клеток не только на третьи сутки, но также на 4 - 7 сутки воздействия вируса. 100%-ная гибель клеток в присутствии препарата ЭМВ наблюдалась на 8 сутки, что на 3 дня позже, чем в контрольной культуре.
Для анализа терапевтического действия препарата ЭМВ  при повторном введении препарата в лунки с клетками, зараженными ВПГ 1 с ИМ 0,0005 БОЕ/мл, препарат ЭМВ вносили через 1 час после заражения и повторно - через 3 суток. В обоих случаях препарат  ЭМВ вносили в концентрации 10 мг/мл. ВПГ 1 вызывал гибель 100% клеток через 5 суток после заражения (контроль). После внесения препарата ЭМВ гибель клеток на 3-и сутки составляла около 5%, на этом сроке в культуру повторно вносили данный препарат. Через 5 суток после повторного внесения препарата (8 суток от начала опыта) наблюдали гибель 40% инфицированных клеток. В это время препарат вносили третий раз. Через сутки после третьей обработки препаратом (9 сутки от начала опыта) наблюдали гибель 50% клеток. Полная гибель клеток отмечена на 10-тые сутки после начала опыта. Таким образом, 3-х кратное применение препарата задерживало развитие инфекционного процесса на 2 суток по сравнению с однократным введением. Изучение повторного действия препарата ЭМВ на ВПГ-инфекцию при более высоких концентрациях ВПГ 1 (ИМ 0,05 и 0,005 БОЕ/мл) оказалось невозможным, так как уже на 2 сутки при указанных концентрациях вируса наблюдали 100%-ное ЦПД как в контроле, так и в опыте.
Таким образом, можно заключить, что в терапевтической схеме препарат  ЭМВ с концентрацией 10 мг/мл задерживает как начало развития вирусспецифического ЦПД (при заражении низкой дозой ВПГ1), так и гибель всех клеток в популяции на трое суток. Повторное внесение препарата ЭМВ  в этой же концентрации не влияет на течение ВПГ-инфекции в клетках Vero.
Для определения вирулицидных свойств препарата ЭМВ его в исследуемых концентрациях инкубировали в течение 1 часа с ВПГ 1 при различной ИМ. Затем инкубационную смесь вносили на монослой клеток Vero и наблюдали в течение 10 дней. Результаты наблюдений через 2 суток после внесения инкубационной смеси представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Вирулицидные свойства СЛ-493 в отношении ВПГ-инфекции


ИМ ВПГ1,
БОЕ мг/мл

Количество погибших клеток, %

Концентрация СЛ-493, мг/мл

Контроль ВПГ1

10

1

0,1

0,01

0,001

 

0,05

100

100

100

100

100

100

0,005

50

50

50

100

100

100

0,0005

0

0

30

30

30

30

повторное введение
0,0005

0

0

0

0

0

30

Показано, что при использовании препарата в концентрациях 10 мг/мл и 1 мг/мл и заражении клеток Vero с низкой ИМ (0,0005 БОЕ/мл) в опыте наблюдали отсутствие ЦПД при 30% ЦПД в контроле без препарата ЭМВ. При инкубации препарата ЭМВ  в концентрациях 10, 1 и 0,1 мг/мл с ВПГ в концентрации 0,005 БОЕ/мл ЦПД вируса составляло 50% по сравнению со 100% - в контроле без препарата ЭМВ. Минимальная концентрация препарата ЭМВ, ингибирующая вирусспецифическое действие ВПГ1 на 50% составляла 0,1 мг/мл (значение ИД50). Показателем противовирусной активности препарата является химиотерапевтический индекс (ХТИ), который рассчитывается как отношение ЦД50 к ИД50. Для препарата ЭМВ ХТИ равен 167. По общепринятым данным, соединение, ХТИ которого превышает или равно 100, считается перспективным препаратом для дальнейших исследований, в том числе на моделях invivo с использованием экспериментальных животных.
При более высокой концентрации вируса (0,05 БОЕ/мл) препарат не обладал вирулицидными свойствами относительно ВПГ1 типа.
Следует отметить, что через 3 суток после внесения смеси ВПГ в концентрациях 0,05 и 0,005 мг/мл с препаратом ЭМВ (партия СЛ-493) во всех изученных концентрациях наблюдали 100%-ное ЦПД как в контроле, так и в опыте, то есть вирулицидное действие препарата ЭМВ отсутствовало. Поэтому опыты с повторным внесением препарата ЭМВ  были проведены при использовании ВПГ1 с ИМ 0,0005 БОЕ/мл. 
ВПГ1 инкубировали с препаратом ЭМВ в 5 концентрациях, указанных в таблице 1, и смеси повторно вносили в лунки с клетками на 3 сутки от начала опыта. Было установлено, что препарат  ЭМВ при повторном введении полностью предотвращает  ЦПД ВПГ1 во всех концентрациях. В то же время в контроле без препарата ЭМВ вирус вызывал 100%-ное  поражение клеток.
Таким образом, повторное внесение препарата ЭМВ,  даже в низких концентрациях (до 0,001 мг/мл) в вирулицидной схеме полностью ингибирует вирусспецифическое ЦПД при заражении ВПГ1с ИМ 0,0005 БОЕ/мл.

Выводы

  1. Токсичность препарата ЭМВ в отношении клеток Vero характеризуется 50%-ной цитотоксической дозой (ЦД50), равной 16,7 мг/мл.
  2. Препарат ЭМВ в концентрации 10 мг/мл обладает частичным терапевтическим эффектом: тормозит начало вирусспецифического ЦПД при заражении ВПГ1 с ИМ 0.0005 БОЕ/мл на 3 суток. Повторные введения препарата ЭМВ усиливают лечебный эффект, задерживая развитие инфекционного процесса и гибель зараженных клеток дополнительно на 2-е суток.
  3. Препарат ЭМВ в концентрации 0,001 мг/мл обладает выраженными вирулицидными свойствами, полностью ингибируя вирусспецифическое ЦПД при двукратном применении. Химиотерапевтический индекс для препарата ЭМВ составил 167.

Таким образом, результаты исследования, проведенного invitro, показали перспективность препарата ЭМВ и целесообразность его дальнейшего изучения в системе in vivo на моделях экспериментальных животных.


Список литературы:
1. Баринский И.Ф. Герпес (этиология, диагностика, лечение)/ И.Ф.  Баринский, А.К Шубладзе., А.А. Каспаров, В.Н.  Гребенюк и др. //    -М.: Медицина,  -1986.   -С. 4-22, 169-173.
2. Whitley R.J., Roizman B. Herpes simplex viruses: is a vaccine tenable? // J. Clin. Invest.  2002. V.110 (2): p.145-151.
3. Sauerbrei A., Wutzler P. Herpes Simplex and varicella-zoster virus infections during pregnancy: current concept of preventions, diagnosis and therapy. Part 1: Herpes Simplex virus infections. Med. Microbiol. Immunol. 2006. V. 24: p 132-141.
4. Kimberlin D.W. Neonatal Herpes Simplex infection. Clin. Microbiol. Rew. 2004. V. 17(1): p.1-13.
5. Whithly R.S. Herpes Simplex Virus (in Fields Virology ed. by DM Knipe and RMHowley). Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2001. p. 2461-2509. 
6. Тихонова Л.И. О состоянии заболеваемости болезнями, передаваемыми половым путем, и мерах по их предупреждению в России/ Л.И.   Тихонова  //  Заболевания, передаваемые половым путем. -1999. - №.4.  – 24 с.
7. Козлова В. И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий / В. И. Козлова, В. И.Пухнер.  –М.:  1997.  – 536 с.