ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГИПЕРТЕНЗИВНОГО ДЕЙСТВИЯ  ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ)
С.В. Захаров, В.П. Герасименя.
ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Исследования проводились на базе Московского государственного университета  им. М.В. Ломоносова (г. Москва) при участии ученых Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского госу-дарственного университета им. М.В. Ломоносова (г. Москва) доктора биологических наук Кирьянова Г.И., доктора биологических наук, профессора Полякова В.Ю. и специалистов ООО «Инбио-фарм»  (г. Москва)  под научным руководством доктора биологи-ческих наук, профессора Медведевой Н.А.  
Артериальная гипертония является одним из самых распространенных заболевания индустриального общества. Она характеризуется повышением артериального системного давления, увеличением общего периферического сопротивления большого круга кровообращения, гипертрофией левого желудочка, и как результат всего этого - сердечной недостаточностью. Эссенсиальная форма системной гипертензии, которой страдают большинство заболевших, как правило, имеет сложную этиологию и патогенез. Одним из основных звеньев увеличения артериального давления является увеличение периферического сопротивления кровеносной системы за счет увеличения активности ренинангиотензивной систе-мы. Исходя из этого, современные антигипертензивные средства в большинстве своем являются, либо антагонистами рецепторов к ангиотензину II (лозаратан), либо блокаторами ангиотензин-превращающего фермента (энап). Все эти препараты имеют большое количество побочных эффектов, к которым относятся нарушение работы желудочно-кишечного тракта, стимуляция кашлевого рефлекса, импотенция и т.д. [1-8]. В связи с этим поиск новых антигипертензивных препаратов является безусловно актуальной проблемой как фундаментальных наук, так и практического здравоохранения.

1. Действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137  (препарата ЭМВ)  на развитие легочной гипертензии у крыс, вызванной введением монокроталина

Известно несколько способов моделирования легочной гипертензии и острого повышения давления в легочных сосудах: гипоксическая и монокроталиновая  модели, гипероксия,  увеличение давления в легочных сосудах с помощью введения антибиотика или липополисахаридов, острой синоаортальной денервации, использования линии крыс, предрасположенных к легочной гипертензии. Одной из наиболее распространенных моделей ЛГ является монокроталиновая модель легочной гипертензии.
Монокроталин (МКТ) макроциклический пирролизидиновый алкалоид, экстрагированный из Crotalaria spectabilis. Многие  пирролизидиновые алкалоиды, продукты тропических растений нескольких родов, токсичны для млекопитающих.
МКТ, вводимый в больших дозах (более 100 мг/кг, подкожно), как и многие другие токсины, вызывает некроз клеток печени. Однако в низких дозах (40-60 мг/кг, подкожно) МКТ селективно действует на эндотелий сосудов легких. Увеличение общей дозы МКТ приводит к нарушениям сосудов почек и тонкого кишечника. Сейчас общепринято мнение, что пневмотоксическим действием обладает не сам МКТ,  а его производное,  образующееся в печени,  возможно, это дегидрогенированный продукт - монокроталин-пиррол. При введении животным МКТ-пиррол имеет более  сильное  токсическое действие на сосуды легких, чем МКТ, его действующая доза в 12-15 раз меньше,  чем у  его  предшественника. Метаболит  достигает легочных сосудов, накапливаясь в эритроцитах. В первую очередь метаболит МКТ действует на эндотелиальные клетки легочных сосудов, вызывая их воспаление с последующим ремоделингом сосудистой стенки. Для монокроталиновой  легочной гипертензии (МКТ-ЛГ) характерно образование тромбов, особенно в посткапил-лярном русле и воспаление легочных вен,  что сближает модель с  легочным  веноокклюзионным  синдромом -  одним из патологоанатомических проявлений первичной ЛГ (Wilson et al., 1992).
Впервые  МКТ был применен в 1965 году для создания модели «легочного сердца».  До развития гипертрофии  и  недостаточности  правых  отделов сердца у крыс, обработанных МКТ, наблюдается тромбоцитопения, скопление макрофагов в адвентиции легочных сосудов и отек  из-за  повышенной проницаемости эндотелиальных  клеток.  Обработка  МКТ подавляет активность систем ферментов,  расположенных на  поверхности  эндотелиальных клеток сосудов легких - ангиотензин-превращающего фермента, активатора плаз-миногена, систем обратного захвата и метаболизма серотонина. Через 3-4 недели,  в  зависимости от дозы МКТ - 40 или 60 мг/кг развивается легочная гипертензия и наблюдается гипертрофия правого желудочка сердца (Wilson et al., 1992). К этому времени уменьшается воспалительная реакция - последствие токсического действия МКТ. Так, например, уменьшается содержание субстанции Р в легочной ткани, которое резко (примерно в 3 раза) возрастает в легких после монокроталиновой инъекции  (Lai et al., 1996 ).
Монокроталиновая модель ЛГ является адекватной моделью ЛГ, на что указывает ряд авторов (Hilliker et al., 1985; Kay et al., 1985; Li et al., 1992; Wilson et al., 1992; Arcot et al., 1993; Уейр и Ривс, 1995; Madden et al., 1995; Mathew et al., 1995; Lai et al., 1996; Morita et al., 1996; Hill et al., 1997; Prie et al., 1998; Kim et al., 1999; Давыдова, 2000; Chen et al., 2001).
По данным международной медицинской информационной базы данных PubMed монокроталиновая модель применяется более чем в 400 публикациях для моделирования ЛГ. По своей этиологии и патофизиологическим проявлениям легочная гипертензия, вызываемая МКТ близка к первичной легочной гипертензии у людей.

Материалы и методы
В исследование участвовали 4 группы животных:

  1. Группа МКТ - животным вводился монокроталин (МКТ). Развитие заболевание происходит в течение 28 дней. После этого животных брали в физиологический эксперимент и гистологическое исследование правого желудочка сердца;
  2. Группа МКТ+Э - животным вводился МКТ и в течение 3-х недель, начиная со второй недели развития заболевания, животным внутрижелудочно, через катетер вводили экстракт  мицелия Pleuro-tusostreatus  1137  (препарат  ЭМВ);
  3. Группа К - животным внутрижелудочно в течение 3-х недель вводится экстракт  мицелия Pleurotusostreatus  1137  (препарат  ЭМВ);
  4. Группа ВК - животные в течение 4-х недель находятся в виварии  - возрастной контроль.

В каждой группе использовалось по 10  животных. Производили измерение веса животных каждую неделю.
Физиологический эксперимент
Через четыре недели животных брали в физиологический эксперимент, в ходе которого животных катетезировали в бедренную вену и артерию и правый желудочек сердца для измерения: системного артериального давления (САД), частоты сердечных сокращений (ЧСС), давления в правом желудочке сердца (ПСД). Для анализа  реактивности сердечно-сосудистой системы проводили регистрацию барорефлекторной  регуляции - изменение ЧСС, в ответ на повышение или понижение  АД. Для повышения АД был использован агонист альфа 1 адрено-рецепторов - фенилэфрин, а для понижения АД - донор оксида азота  нитропруссид (НП) натрия.
После физиологического эксперимента производили взвеши-вание правого отдела сердца животных, как показатель развития гипертрофии. Кроме того, были сделаны гистологические препараты правого желудочка сердца животных всех экспериментальных групп.
Эффект действия препарата был тестирован по изменению ПСД, САД, сдвигу барорефлекторной регуляции сердца, степени гипертрофии сердца и сосудов.
Результаты   
Результаты измерения веса крыс за все 4 недели эксперимента показали, что средний прирост веса животных в контрольной группе составил 0,113 ± 0,005 кг, что достоверно больше ( р<0,05) прироста веса в группе, принимавшей препарат экстракт (0, 098 ±  0,006 кг).
У всех животных перед введением препарата ЭМВ производили регистрацию среднего и систолического системного давления, частоты сердечных сокращений, а также среднего и систолического давления в правом желудочке сердца.
Полученные данные показали, что в контрольной группе среднее артериальное давление составляло 121,18 ± 2,81 мм рт. ст., что было достоверно (р< 0,05) выше артериального давления ( 103,67± 3,66)  в группе животных, потреблявших препарат ЭМВ. Однако на давление в правом желудочке сердца у контрольных животных препарат ЭМВ не влиял. В контрольной (К) и экспериментальных (Э) группах среднее и систолическое право-желудочковое давление составляло 18,5 ± 2,64   и 16,57 ± 0,96 , и 30,2 ± 2,3   и 30,53 ± 1,82 соответственно.
Анализ реактивности сердечно-сосудистой системы в ответ на  введение гипертензивного агента - фенилэфрина в дозе 1,5 мкг/кг показал, что изменение среднего АД в ответ на введение ФЭ у животных в контрольной группе составило 27,73 ± 0,83 мм рт. ст., что достоверно больше ( р<0,05) среднего АД, равного  21, 74 ±  2,22 мм рт.ст. в группе, принимавшей препарат ЭМВ.
Влияние ФЭ на систолическое артериальное давление имеет такую же тенденцию, как и на среднее артериальное давление. В контрольной группе (К) ответ составлял 34,14 ± 1,00 мм рт. ст., 21,31 ± 1,29 мм рт. ст., в  экспериментальной группе (Э) - 16,7 ± 2,4 мм рт. ст.
В контрольной группе изменение ЧСС, в среднем, составляло 18,1 ± 0,9 мм рт. ст., что достоверно (р< 0,05) ниже ЧСС в группе, потреблявших  препарат ЭМВ ( 25, 7± 4,7 мм рт. ст.).
Достоверного изменения реакции  давления в правом желудочке сердца у контрольных животных в ответ на ФЭ препарат ЭМВ не вызывал. В группах К и МКТ+Э среднее изменение правожелу-дочкового давления (ПЖД) было равно 6,0 ± 1,1 и 7,9 ± 1,1  мм рт. ст. соответственно.
Влияние ФЭ на систолическое ПЖД имеет такую же тенденцию, как и на среднее ПЖД. В контрольной группе   ответ составлял 8,3 ± 0,8 мм рт. ст., 10,4 ± 1,2 мм рт. ст. в группе МКТ + Э; 3,6 ± 0,3 мм рт. ст.
Было показано, что изменение среднего  АД в ответ на введение НП у  животных в контрольной группе составил -18,7 ± 0,1 мм рт. ст., что достоверно больше ( р<0,05) изменения среднего  АД, равного - 20, 8 ±  1,8 мм рт.ст. в группе, принимавшей препарат ЭМВ.
Влияние ФЭ на систолическое артериальное давление имеет такую же тенденцию, как и на среднее артериальное давление. В контрольной группе   ответ составлял -25,5 ± 1,5 мм рт. ст., -20,3 ± 1,8 мм рт. ст. в группе МКТ+Э; -16,8 ± 2,0 мм рт. ст.
В контрольной группе изменение ЧСС, в среднем,  было равно 16,1 ± 0,7 мм рт. ст., что достоверно (р> 0,05) не отличалось от такового  (15, 7± 2,3 мм рт. ст.)  в группе, потреблявших препарат ЭМВ.
Достоверного изменения реакции давления в правом желудочке сердца у контрольных животных в ответ на НП препарат ЭМВ не вызывал. В группах К и МКТ+Э среднее изменение правожелудочкового давления было равно -3,5 ± 0,4   и -3,4 ± 0,6  мм рт. ст. соответственно.
Влияние НП на систолическое ПЖД имеет такую же тенденцию, как и на среднее ПЖД. В контрольной группе ответ составлял -3,7 ± 0,4 мм рт. ст., -4,3 ± 1,0 мм рт. ст. в группе МКТ+Э; -2,6 ± 0,3 мм рт. ст.
Из полученных данных видно, что коэффициент чувствитель-ности барорефлекса в группе МКТ+Э достоверно не отличается от такового в контроле.
Обсуждение  
Полученные данные позволяют прийти к заключению о том, что хроническое применение препарата ЭМВ крысам с легочной гипертензией (монокроталиновая модель) не приводило к уменьшению симптомов заболевания и улучшению состояния модельных животных.
В целом, полученные данные показывают, что у нормо-тензивных крыс линии Wistar хроническое (в течение 3 недель) внутрижелудочковое применение экстракта приводило к уменьшению следующих физиологических показателей: веса тела, среднего системного артериального давления, частоты сердечных сокращений, относительного веса левого желудочка и реактивности к сосудосуживающим факторам. При этом наблюдалось увеличение чувствительности барорефлекса к сосудосуживающим факторам и увеличение чувствительности к сосудорасширяющим факторам.
Полученные данные позволяют рассматривать препарат ЭМВ как  потенциально возможное антигипертензивное средство.

2. Антигипертензивное действие препарата ЭМВ на модели нормотензивных крыс и линейных гипертензивных крыс линии SHR в острых опытах на бодрствующих животных

Материалы и методы
Согласно результатам, полученным на нормотензивных животных, хроническое внутрижелудочное введение препарата  ЭМВ  в течение трех недель приводило к достоверному снижению системного артериального давления,  уменьшению реактивности к сосудосуживающим факторам и восстановлению рефлекторной регуляции АД. Это позволяет высказать предположение, что исследуемый препарат может обладать антигипертензивным действием. В связи с вышеизложенным было проведено исследование действия препарата  ЭМВ  при его внутривенном введении крысам линии SHR и нормотензивным животным (острый эксперимент).
В исследование вводилось 4 группы животных.

1. Группа Wistar - нормотензивные животные линии Wistar, которым в течение физиологического эксперимента вводили растворитель 4 раза с интервалом в 10 -15 мин.

2. Группа Wistar + ЭМВ - нормотензивные животные линии Wistar, которым в течение физиологического эксперимента вводили препарат  ЭМВ последовательно 4 раза с интервалом 10 -15 мин.

3.  Группа SHR - спонтанно гипертензивные животные линии SHR, которым в течение физиологического эксперимента вводили растворитель, 4 раза с интервалом в 10 -15 мин. 

4.  Группа SHR + препарат ЭМВ - спонтанно гипертензивные животные линии SHR, которым в течение физиологического эксперимента вводили препарат  ЭМВ последовательно 4 раза с интервалом 10 -15 мин. 

В каждой группе использовалось по 8  животных.
Животных брали в физиологический эксперимент, в ходе которого в бедренную вену и артерию вводили катетеры для измерения: системного артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Для анализа реактивности сердечно-сосудистой системы проводили регистрацию барорефлекторной  регуляции сердечно-сосудистой системы - изменение ЧСС в ответ на повышение или понижение АД. Для повышения АД был использован агонист альфа1 адренорецепторов - фенилэфрин, а также пептид ангиотензин II, а для понижения АД - донор оксида азота - нитропруссид натрия. Для изучения действия экстракта на реактивность сердечно-сосудистой системы животным повторно вводили фенилэфрин, нитропруссид натрия и ангиотензин II после четырехкратного введения либо растворителя, либо экстракт в дозах 10мг/кг в объеме 15 мкл. В качестве растворителя использовался физиологический раствор.
Об эффекте действия препарата судили по изменению САД, реакции АД и ЧСС на сосудосуживающие и сосудорасширительные факторы, а также барорефлекторной регуляции сердца.    


  Cхема эксперимента

Результаты анализа реактивности сердечно-сосудистой системы в ответ на  введение гипертензивного агента – фенилэфрина в дозе 1,5 мкг/кг.

В таблице 1 приведены результаты изменения среднего, систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений (n=8) в ответ на введение фенилэфрина (ФЭ) в дозе 1,5 мкг/кг во всех экспериментальных группах нормотензивных  (Wistar)и гипертензивных животных (SHR).
Таблица 1. Результаты изменения среднего, систолического артерииального давления и частоты сердечных сокращений в ответ на введение фенилэфрина (ФЭ) в дозе 1,5 мкг/кг в контрольных и опытных группах крыс Wistar и SHR .


Группы животных

 

до введения

 

 

после введения

 

 

ФЭ

ср

сис

чсс

ср

сис

чсс

Wistar

 

 

 

 

 

 

 

Δ реакции

Среднее

23,7

25,1

-52,0

22,8

24,2

-53,0

 

Стан.откл.

1,1

2,0

5,7

1,1

2,0

5,7

 

Ош.сред..

0,5

0,8

2,3

0,5

0,8

2,3

Wistar+Х

 

 

 

 

 

 

 

Δ реакции

Среднее

23,9

25,5

-45,2

2,82

2,81

-0,1

 

Стан.откл.

2,9

2,6

4,1

1,44

1,45

6,2

 

Ош.сред..

1,2

1,1

1,7

0,59

0,59

2,5

SHR

 

 

 

 

 

 

 

Δ реакции

Среднее

23,0

24,8

-15,0

22,8

26,3

-21,3

 

Стан.откл.

4,3

4,9

3,7

5,1

4,1

2,3

 

Ош.сред..

1,8

2,0

1,5

2,1

1,7

1,0

SHR+X

 

 

 

 

 

 

 

Δ реакции

Среднее

23,5

26,7

-21,4

7,0

8,8

-8,8

 

Стан.откл.

9,9

11,2

12,4

4,6

4,7

4,6

 

Ош.сред..

4,0

4,6

5,1

1,9

1,9

1,9

 

Показано, что изменение среднего АД в ответ на введение ФЭ у нормотензивных животных линии Wistar контрольной группы в начале эксперимента составило 23,7 ± 0,5 мм рт. ст., что достоверно не отличалось от изменения среднего АД, равного 22, 8 ±  0,5 мм рт.ст. в конце эксперимента, после 4-х кратного введения растворителя. Сравнение изменения среднего АД в ответ на введение ФЭ у животных в группе Wistar+Х показало, что в начале эксперимента оно составляло 23,9 ± 1,2 мм рт. ст., а в конце опыта, после 4-х кратного введения препарата ЭМВ , - (2,8 ±  0,6) мм рт.ст,  различия достоверны ( р<0,05).
В группе животных линии SHR изменение среднего АД в ответ на введение ФЭ в начале эксперимента составило 23,0± 1,8 мм рт. ст., что достоверно не отличалось от изменения среднего АД, равного  22, 8 ±  2,1 мм рт.ст. после 4-х кратного введения растворителя. Изменение среднего АД в ответ на введение ФЭ у животных в группе SHR+  препарат ЭМВ в начале эксперимента составило 23,5 ± 4,0 мм рт. ст., что достоверно отличалось (р<0,05) от изменения среднего АД, равного 7,0 ± 1,9 мм рт.ст. после 4-х кратного введения экстракта.
Достоверных отличий в реакции АД на фенилэфрин после введения экстракта между нормо- и гипертензивными животными не было.


Рисунок 1 - Изменение среднего артериального давления у всех групп крыс в ответ на введение ФЭ в дозе 1,5 мкг/кг

На рисунке 2 приведены данные изменения частоты сердечных сокращений в ответ на введение ФЭ в дозе 1,5 мкг/кг.


Рисунок 2 - Изменение частоты сердечных сокращений у всех групп крыс в ответ на введение ФЭ в дозе 1,5 мкг/кг

В контрольной группе изменение ЧСС, в ответ на изменение АД, вызванное введением ФЭ, в среднем, было равно -52,0 ± 2,3 уд/мин, что достоверно не отличалось от ЧСС (-53,0 ± 2,3 уд/мин) в контрольной группе, после введения растворителя.
Изменение ЧСС у животных Wistar+ препарат ЭМВ достоверно (р > 0,05) уменьшалось после введения препарата ЭМВ: -45,2 ± 1,7  и -0,1 ± 2,5 уд/мин соответственно, что, по-видимому, связано с уменьшением реакции АД на введение фенилэфрина после 4-х кратного введения исследуемого препарата.
Уменьшение ЧСС в ответ на возрастание АД, вызванного введением ФЭ, у животных SHR достоверно изменялось по сравнению с нормотензивными животными линии Wistar как в начале эксперимента, так и  после введения растворителя и составляло -15,0 ± 1,5 и -21,3 ± 1,0 уд/мин соответственно. Введение препарата ЭМВ у этих крыс достоверно снижало уменьшение ЧСС в ответ на изменение АД, вызванного введением фенилэфрина, с -21,4 ± 5,1 до -8,8 ± 1,9 уд/мин. 
Этот эффект, по-видимому, так же, как и в случае нормотензивных животных линии Wista,r связан с уменьшением реакции на ФЭ после 4-х кратного введения исследуемого препарата.
Необходимо отметить, что частота сердечных сокращений изменялась в достоверно меньшей степени у гипертензивных крыс в ответ на сравнимую реакцию АД, вызванную введением ФЭ, относительно нормотензивных животных линии Wistar, что соответствует литературным данным.
Таблица 2 - Коэффициент чувствительности барорефлекса в ответ на введение фенилэфрина в дозе 1,5 мкг/кг у всех экспериментальных животных

 

 

 

 

Wistar

 

до введения

после введения

КБР

Среднее

-2,197732958

-2,330119503

 

Стан.откл.

0,269318908

0,283572787

 

Ош.сред..

0,109948984

0,115768106

Wistar+Х

 

 

 

КБР

Среднее

-1,901318178

-0,161862713

 

Стан.откл.

0,087963253

1,8931539

 

Ош.сред..

0,035910848

0,772876843

SHR

 

 

 

КБР

Среднее

-0,647979313

-0,962760605

 

Стан.откл.

0,063856462

0,161835089

 

Ош.сред..

0,026069291

0,066068898

SHR+X

 

 

 

КБР

Среднее

-0,898323161

-1,139021402

 

Стан.откл.

0,455337088

0,418010555

 

Ош.сред..

0,185890588

0,170652094

    Из полученных данных видно, что коэффициент чувствительности барорефлекса в группе Wistar+Х почти в 10 раз снижался после введения экстракта. Но в группе SHR+Э препарат достоверно не влиял на коэффициент барорефлекса. Введение растворителя не влияло на коэффициент барорефлекса ни контрольной, ни группы гипертензивных животных.

Читать дальше ›››