ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗМОЖНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ)  И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ

 Г.И. Кирьянов,  **С.В.Захаров,  **В.П. Герасименя,  
*Е.М. Лазарева,  *М.И. Мурашева, *Л.В. Исаева,  *В.Ю. Поляков.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

 *НИИ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В.  Ломоносова, Биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии, Москва, Россия;

 **ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Несмотря на большой интерес, который проявляют к экст-рактам базидиальных грибов представители различных направлений медицины и фармакологии, до настоящего времени не определены молекулярные мишени, с которыми взаимодействуют компоненты экстрактов на организменном и клеточном уровнях.
Нами показано, что в части культивируемых клеток экстракт мицелияPleurotusostreatus1137 вызывает появление хромосомных аберраций [1,2,3]. Аналогичные аномалии митозов возникают после действия циклофосфана, который, по данным литературы, вызывает «слипание» ДНК. В соответствии с этим, наблюдаемые нами в анафазах и телофазах хромосомные аберрации типа «мост» (после действия экстракта) могут рассматриваться, как следствие неспецифического «сшивания» ДНК в интерфазных ядрах. В то же время наличие большого количества клеток с несколькими ядрами (поликарионов) показывает, что циклофосфан и экстракт частично или полностью блокируют процесс нормального прохождения митоза на стадии метафазы. В современной литературе появление микроядер в делящихся клетках связывают с явлением, которое получило название «митотическая катастрофа» [1]. Показано, что митотическая катастрофа может контролироваться комбинированной системой факторов, включающих белки «критических точек» цикла (в том числе, ответственные за целостность ДНК генома и формирование митотического веретена), некоторыми фармакологическими агентами, а также апоптотическими факторами, в том числе, каспазами и/или представителями семейства Bcl-2.
Появление характерных хромосомных аберраций в клетках, обработанных экстрактом, свидетельствует, что одной из возможных мишеней его действия, прямого или опосредованного, является ДНК. Известно, что в клеточных ядрах ДНК в ассоциации с белками (гистонами) формирует высокоупорядоченные комплексы (хрома-тин), которые контролируют ее доступность для ряда эндогенных и экзогенных факторов, в том числе для факторов, регулирующих транскрипцию. Если, действительно, одной из мишеней для экстракта (или, его компонентов) является именно ДНК, то логично предположить, что искусственная декомпактизация хроматина может приводить к усилению эффекта действия экстракта. Эта идея была реализована с использованием реагентов, существенно изменяющих структуру хроматина - 5-азацитидина и бутирата Na  [4].
Сочетанное действия экстракта с факторами, влияющими на структурно-функциональное состояние хроматина
Работа проводилась на трансформированных клетках HeLa.
Для оценки индивидуального действия 5-азацитидина реагент добавлялся к культивируемым клеткам на 56 час (48 час - время, соответствующее двум клеточным циклам; 8 час - время, принятое в работе для анализа митостатического и апоптогенного действия экстракта и циклофосфана).
Полученные данные показывают, что после обработки 5-азацитидином в концентрации 20 мкМ/мл количество делящихся клеток снижается приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем (рисунок 1 А, Б). Это означает, что уменьшение уровня метилирования ДНК, индуцированное включением в реплицирующуюся ДНК раковых клеток 5-азацитидина, является ингибитором пролиферации.
Эффект блока митозов под действием 5-азацитидина показан на культуре клеток [4].
При индивидуальном использовании 5-азацитидин более чем в 10 раз повышает количество клеток, включивших программу апоптотической гибели (рисунок 2 Б). 
Для оценки сочетанного действия 5-азацитидина и экстракта, через 48 час инкубации клеток в присутствии 5-азацитидина в среду культивирования добавлялся экстракт в концентрации 100 мкг/мл и клетки инкубировали 8час в присутствии экстракта. При такой постановке эксперимента экстракт повышает митотический индекс, по-видимому, за счет блокирования митозов (рисунок 1 В). 
Добавление экстракта после 48 часов инкубации клеток с 5-азацитидином повышает долю апоптотических клеток в популяции примерно в 1,5 раза по сравнению с индивидуальным действием 5-азацитидина (рисунок 2 В). Сочетанное применение 5-азацитидина, экстракта и циклофосфана, дополнительно усиливает митоста-тический эффект (рисунок 1 Г). 
Для оценки индивидуального действия бутирата Na реагент добавлялся к клеткам в концентрации 5 мг/мл среды на 9 час.
Для оценки сочетанного действия бутирата и экстракта использовалось несколько способов введения реагентов.
При индивидуальном использовании бутират в 2 раза повы-шает митотический индекс по сравнению с контролем (рисунок 3 А, Б), что свидетельствует о его митостатическом действии.
Это означает, что изменение уровня ацетилирования гистонов, индуцированное действием бутирата, повышает доступность ДНК.
При сочетанном использовании с экстрактом после после-довательного или одновременного добавлении реагентов бутират не изменяет значение митотического индекса по сравнению с его индивидуальным действием (рисунок  3 В, Г). 
После предварительной обработки бутиратом и последующим одновременном введением экстракта и циклофосфана наблюдается незначительное увеличение митотического индекса (рисунок 3 Д). 
При индивидуальном использовании бутират более чем в 2 раза увеличивает долю клеток, находящихся в состоянии апоптоза (рисунок 4 А, Б).
При сочетанном действии бутирата и экстракта (1 час инкубации в присутствии бутирата, добавление экстракта и инкубация 7 часов), доля клеток, вступивших в апоптоз, увеличивается примерно в 5 раз по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с индиви-дуальным действием бутирата (рисунок 4 В). 
В целом, полученные результаты показывают, что модифи-кация структуры хроматина (частичная декомпактизация) делает его более доступным для факторов, индуцирующих апоптоз. В этих случаях экстракт действует как проапоптотический агент.

Определение роли митохондрий, как возможных мишеней действия экстракта на индукцию апоптоза
Известно, что в индукции апоптотической гибели клеток важная роль принадлежит митохондриям. По некоторым данным, митохондрии не только участвуют в реализации программы апоптоза, но и служат важнейшим сенсором, способным иници-ировать гибель клетки (Skulachev et al., 2009). Если апоптоз развивается по «каноническому» пути, то это сопровождается выходом из митохондрий белка цитохрома С  [1].
В жизнеспособных клетках HeLa цитохром С локализуется в митохондриях, которые, в основном, представлены нитчатыми формами (рисунки 5, 6). Обработка клеток экстрактом не приводит к существенному изменению формы митохондрий и выходу цитохрома в цитоплазму. Обработка клеток циклофосфаном также не приводит к появлению в популяции значительного количества клеток с признаками апоптоза. После окрашивания антителами к белку цитохрому С сохраняется его локализация в митохондриях (рисунок  7).
При сочетанной обработке (экстракт 1 час, затем добавление циклофосфана и последующая инкубация клеток 8 час) на препаратах выявляются апоптотические клетки, в которых наблюдается значительные изменения структуры митохондрий (набухание и «ошаривание»), однако выхода цитохрома в цитоплазму также не наблюдается.

Индивидуальное и сочетанное с циклофосфаном действие экстракта на плазматические мембраны клеток
Для определения клеток с измененными свойствами мембран, использовали прижизненное окрашивание красителем трипановым синим. Количественный анализ показал, что доля окрашенных клеток в значительной степени зависит от дозы экстракта.
В популяции культивируемых клеток в небольшом количестве присутствуют клетки, окрашивающиеся трипановым синим (рисунок 8). После 8 часов индивидуального воздействия экстракта в концентрации 50 мкг/мл доля окрашенных клеток возрастает примерно в 2 раза, а после использования экстракта в дозе 100 мкг/мл - примерно в 3 раза (рисунок 8). 
Более длительная инкубация (24 часа) практически не приводит к возрастанию доли окрашенных клеток, тогда как пролон-гированная инкубация с экстрактом увеличивает долю окрашенных клеток в 4 раза при концентрации 50 мкг/мл и примерно в 9 раз при концентрации 100 мкг/мл (рисунок  8). 
На основании этих экспериментов можно предположить, что «первичной» мишенью действия экстракта являются плазма-тические мембраны.

Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на культивируемые фибробласты
Экстракт и циклофосфан как при раздельной, так и при сочетанной обработке не приводят к индукции апоптотической гибели фибробластов (рисунок 9, А - К). 
На основании перечисленных данных можно сделать предварительное заключение о том, что клеточный ответ трансформированных (раковых) и нормальных клеток на инди-видуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана принципиально различается.
Таким образом, согласно изложеным выше результатам, экстракт обладает синергизмом действия с медицинскими цито-статиками на процессы деления и индукцию апоптоза в культивируемых трансформированных клетках. Анализ различных способов инсталляции экстракта и медицинских цитостатиков показыает, что для индукции апоптоза наиболее эффективна предварительная обработка клеток экстрактом в дозе 100 мкг/мл (1 час) с последующим введением цитостатиков (7 час). При этом эффективность апоптогенного действия экстракта сильно зависит от типа цитостатика.
В ранних работах показано, что эффективность действия цитостатиков в значительной степени зависит от состояния окислительно-восстановительных систем клетки и от присутствия метаболических активаторов [1,2,3]. Это согласуется с предполо-жением, что противоопухолевый эффект экстрактов медицинских грибов не связан непосредственно с их цитотоксическим действием, а, скорее, приводит к активации некоторых ферментных систем, в том числе, супероксиддисмутазы [4].
Известно, что функциональный статус как нормальных, так и трансформированных клеток во многом определяется сигналь-ными системами, локализованными в плазматических мембранах. В частности, на плазматических мембранах экспонированы рецепторы, контролирующие включение программы клеточной гибели (апоптоза). Используя витальное окрашивание клеток, культивируемых в присутствии экстракта, мы показали, что именно модификация плазматических мембран является «первичным» ответом клетки на действие экстракта. При этом важно, что такую реакцию демонстрируют не все клетки популяции. На основании этих данных логично предположить, что экстракт в определенных дозах детерминирует переход части клеток в «предапоптотическое» состояние. В результате, последующая обработка цитостатиками, мишенью которых является геном клетки, приводит к включению программы апоптоза. Аналогичный результат дает последовательная обработка клеток низкими и высокими дозами экстракта. Этот чрезвычайно интересный факт можно объяснить тем, что низкие дозы экстрака «сенсибилизирут» клетки для действия проапоптотических факторов, которые активируются при повторном введении экстракта.
Принципиально важно, что апоптогенное действие экстракт в синергизме с цитостатиками оказывает только на трансформи-рованные клетки, тогда как нормальные фибробласты не включают программу апоптоза при тех же дозах экстракта и цитостатиков.


Рисунок 1 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие 5-азацитидина на пролиферативную активность (клетки HeLa)

А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - 5-азацитидин (20 мкМ), 56 часов инкубации;
В - 5-азацитидин (20 мкМ), 48 часов инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г - смесь 5-азацитидина (20 мкМ) и экстракта (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.


Рисунок 2 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие 5-азацитидина на индукцию апоптоза (клетки HeLa)

А - контроль;
Б - 5-азацитидин, 56 часов;
В - 5-азацитидин, 48 часов, добавление экстракта (100 мкг/мл) на 8 часов;
Г - 5-азацитидин, 48 часов, добавление экстракта (100 мкг/мл) на 1 час, добавление циклофосфана (300 мкг/мл) на 7 часов


Рисунок 3 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие бутирата натрия на пролиферацию (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - бутират (5 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - бутират (5 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Г - смесь бутирата (5 мкг/мл), экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Д - бутират (5 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации


Рисунок 4 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и цикло-фосфаном действие бутирата натрия на индукцию апоптоза (клетки HeLa)

А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - бутират (5 мг/мл), 8 часов инкубации;
В - бутират (5 мг/мл) 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Г - смесь бутирата (5 мг/мл), экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.
Д - бутират, 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл) и экстракта (100 мкг/мл).


Рис. 5 - Окраска родамином (клетки HeLa)
А - контроль, нитевидные митохондрии (стрелка);
Б  - действие циклофосфана, митохондрии сферические (стрелка);
В - действие экстракта, в некоторых клетках митохондрии укорочены (стрелка).


Рис. 6 - Окраска антителами против цитохрома С (клетки HeLa)
А, Б- контроль, окраска локализуется в нитчатых митохондриях;
В, Г - действие циклофосфана, митохондрии приобретают сферическую форму, цитохром не выходит из митохондрий.


Рисунок 7 - Сочетанное действие экстракта и циклофосфана на плазматические мембраны (клетки HeLa)

А - контроль 8 часов инкубации;
Б -  экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло-фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;
В -  экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло-фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Г - цикофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Д - цикофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации.

 


Рисунок 8 - Действие экстракта и циклофосфана на плазматические мембраны (клетки HeLa)

А – контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г - циклофосфан (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Е – контроль, 24 часа инкубации;
Ж - экстракт (50 мкг/мл), 24 часа инкубации;
З - экстракт (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;
И - циклофосфан (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;
К - циклофосфан (300 мкг/мл), 24 часа инкубации


Рисунок  9 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию и индукцию апоптоза нормальных фибробластов человека
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Е - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Ж - экстракт (50 мкг/мл), 7 часов инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;
З - экстракт (100 мкг/мл), добавление циклофосфана (300 мкг/мл),  7 часов инкубации;
И - смесь экстракта (50 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;
К - смесь экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации.


Список литературы:
1. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotusostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток / В.Ю.Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др.   // Журнал «Биологические мембраны».- 2007. Том 24. №5. -С. 379-388.
2. Анализ действия водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки на цитокинетические параметры культивируемых клеток в норме и при воздействии цитостатика циклофосфана: Отчет о НИР   / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. и др.  - М., ООО ИЛЦ «Универсал». 2005. - 40 с.
3.Анализ действия водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки на цитокинетические параметры культивируемых клеток в норме и при воздействии цитостатика циклофосфана: Отчет о НИР   / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. и др.   - М., ООО ИЛЦ «Универсал». 2005. - 34 с.
4. Изучение и установление механизма действия «Экстракта мицелия вешенки  «ОВОДОРИН» : Отчет о НИР / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. Захаров С.В. и др. - М.. ООО Испытательный лабораторный центр «Универсал». 2009. -49.
5. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии эксперимен-тального стеатоза печени / В.Ю. Поляков, С.А. Голышев, Г.И. Кирьянов, Е.А. Арифулин, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, К.З. Гумаргалиева, Ю.Л. Путырский //Биологические мембраны. -2011, том 28, №4.- С. 1-7.