ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) 
НА ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
В СИСТЕМЕ in vitro

В.Ю. Поляков, **С.В.Захаров,**В.П. Герасименя, *Е.М. Лазарева, *М.И. Мурашева, *Л.В. Исаева, Г.И. Кирьянов.
МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;
*НИИ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В.  Ломоносова, Биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии, Москва, Россия;
**ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

В современной онкологии широко применяется стратегия комбинированной терапии с использованием определенной после-довательности введения цитостатических и стимулирующих агентов, варьирования дозы и времени воздействия. В рамках этой стратегии особенно перспективно применение иммуностимуляторов, так как многие цитостатики (например, доксорубицин, циклофосфан и его производные) являются ярко выраженными иммунодепрессантами [1-4]. В связи с тем, что полисахаропептиды некоторых медицинских грибов индуцируют у экспериментальных животных продукцию гаммаинтерферона, интерлейкина-2, пролиферацию Т-клеток, их рекомендовано применять при химио- и радиотерапии рака и для лечения различных инфекционных заболеваний [5]. Другой возможный подход к детоксикации организма - снижение дозы токсикогенных лекарственных препаратов при одновременном сохранении эффективности их действия. В этом плане особый интерес представляет изучение совместного (сочетанного) действия экстрактов грибов и токсических лекарственных препаратов. Если будет показано, что экстракты обладают свойством изменять «доступность» клеток для химотерапевтических агентов, их можно рекомендовать для использования в качестве «препаратов сопровождения» при химиотерапии опухолей или других тяжелых патологий, требующих применения сильнодействующих токсических средств.
В работе проведен сравнительный анализ индивидуального и сочетанного действия экстракта гриба Pleurotesostreatusи медицинских цитостатиков на культивируемые (трансформированные и нормальные) клетки человека.
В качестве модели использовались культивируемые трансформированные клетки человека (HeLa), клетки миелоидного лейкоза человека (линия К-562), клетки почки зеленой мартышки (линия Vero) и нормальные фибробласты человека. Модель культивируемых клеток исключает многие трудноучитываемые факторы, опосредующие действие экстракта и его отдельных фракций на уровне целого организма, и позволяет тестировать ряд функциональных показателей эффективности действия препарата в строго контролируемых и воспроизводимых условиях. Особый акцент сделан на анализе сочетанного действия экстракта и медицинских цитостатиков.
Для количественной оценки эффективности действия цитоста-тиков и экстракта использовались показатели, характеризующие жизнеспособность популяции культивируемых клеток: митотический индекс (доля клеток, находящихся в состоянии деления) и апоптотический индекс (доля клеток с выраженными признаками программируемой смерти). Функциональное состояние плазматических мембран оценивалось по способности клеток к витальному окрашиванию трипановым синим.

Индивидуальное и сочетанное с медицинскими цитостатиками действие экстракта на жизнеспособность нормальных и трансформированных клеток в системе invitro
Работа включает 2 этапа.
На первом этапе проведен анализ реакции трансформированных клеток HeLa на индивидуальное действие экстракта. Определение доли делящихся клеток (митотического индекса) в контрольных и обработанных экстрактом клетках показывает, что экстракт в дозе 50 мкг/мл и 100 мкг/мл практически не изменяет этот показатель через 8 часов инкубации (рисунок 1, А, Б, В). Детальный цитологический анализ клеток, культивировавшихся в присутствии экстракта, показал, что при этом в популяции появляются митозы с выраженными признаками патологии (рисунки 12,13). Значительное возрастание митотического индекса, сопровождающееся увеличением количества клеток с патологическими митозами, наблюдается через 24 часа воздействия (рисунок 1, Г, Д, Е). Таким образом, экстракт при его индивидуальном использовании индуцирует патологию митозов.
Если после 8 часов обработки клетки отмыть от экстракта и перевести в нормальную среду на 18 часов, количество делящихся клеток снижается до контрольных значений, однако патологические митозы в популяции сохраняются (рисунок 1, Ж).
Определение доли клеток, включивших программу гибели (апоптотический индекс), показало, что при индивидуальном действии, в условиях однократного введения в среду культивирования, экстракт, независимо от использованной дозы, практи-чески не является индуктором апоптоза (рисунок 2, А, Б, В). 
Неожиданный и интересный результат дал метод после-довательного двукратного введения повышающихся доз экстракта. После 3 дней культивирования к культуральной среде добавлялся экстракт в концентрации 50 мкг/мл на 8 часов, а затем экстракт в концентрации 100 мкг/мл. После повторного введения экстракта клетки инкубировали 16 час. Полученные результаты показывают, что использованный протокол воздействия повышает долю апоптотических клеток в популяции примерно в 10 раз (рисунок 7, А, Б). 
На втором этапе изучено индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие цитостатиков циклофосфана, доксорубицина и метотрексата, применяющихся при химиотерапии опухолей.
Циклофосфан относится к классу алкилирующих соединений, действие которых обусловлено, в первую очередь, модификацией пуриновых и пиримидиновых оснований, в результате чего нарушается целостность молекул ДНК. Клетки после воздействия алкилирующих соединений останавливаются в G1 фазе и не входят в S-фазу. Высокой чувствительностью к этим веществам обладают клетки гиперплазированных (опухолевых) тканей и лимфоидной ткани. В настоящее время циклофосфан активно применяется в терапии злокачественных опухолей и некоторых других заболеваний [1-4]. Его цитостатические свойства связаны с индукцией однонитевых разрывов в ДНК и формированием поперечных «сшивок» между молекулами ДНК. На клеточном уровне мутагенность циклофосфана тестируется по возникновению большого количества обменов между сестринскими хроматидами и появлению клеток с многочисленными микроядрами. По нашим данным, при индивидуальном действии циклофосфана в концентрации 100 и 300 мкг/мл на культивируемые клетки в течение 8 часов показатель митотического индекса незначительно возрастает за счет увеличения количества клеток с патоло-гическими митозами (рисунок 1, З, И, К). Особенно много клеток с патологическими митозами появляется после 24 часов инкубации в присутствии циклофосфана (рисунок 1, Л, М, Н).
Определение апоптотического индекса показало, что при индивидуальном действии циклофосфана количество апопто-тических клеток увеличивается с возрастанием дозы препарата (рисунок 2, Г, Д).  С этим согласуются данные, показывающие, что циклофосфан, как и некоторые другие иммунодепрессанты, является индуктором апоптоза [1-4]. В наших экспериментах циклофосфан приводил примерно к двукратному возрастанию количества апоптотических клеток в популяции, независимо от дозы и длительности обработки.
Таким образом, действие циклофосфана приводит к апопто-тической гибели клеток в интерфазе, к появлению клеток с признаками «митотической катастрофы» и вызывает в части клеток, завершивших деление, структурно-функциональный дисбаланс генома. При этом эффект цитостатического действия циклофосфана на культивируемые клетки зависит от дозы препарата и времени его воздействия.
Принципиально важные результаты получены при анализе сочетанного действия циклофосфана и экстракта. В этой серии экспериментов мы использовали концентрацию циклофосфана 300 мкг/мл, которая эквивалентна «терапевтической» дозе, применяемой в химиотерапии опухолей, и которая оказывает более выраженное действие на клетки HeLa при индивидуальном использовании.
При сочетанном использовании экстракта и циклофосфана проявляется их ярко выраженное синергетическое действие на деление клеток (рисунок 3). При этом полученные данные показали, что конечный результат экспериментов зависит от дозы экстракта и от способа внесения экстракта и цитостатика в среду культивирования.
При концентрации экстракта 50 мкг/мл и циклофосфана 300 мкг/мл наблюдается значительное увеличение митотического индекса за счет возрастания доли патологических митозов (рисунок 3, Б).  Это значит, что вхождение клеток в митоз при этих дозах не блокируется, однако митозы не завершаются. При сочетанном действии экстракта в концентрации 100 мкг/мл и циклофосфана 300 мкг/мл митотический индекс понижается примерно в 2 раза по сравнению с контролем, что свидетельствует о подавлении пролиферации (рисунок 3, В). 
В том случае, когда перед инсталляцией экстракта в дозе 50 мкг/мл клетки инкубировались с циклофосфаном 1 час, митотичес-кий индекс не отличается от контроля. При 100 мкг/мл экстракта количество делящихся клеток уменьшается (рисунок 3, Г, Д). 
Наиболее интересный феномен наблюдается в экспериментах по влиянию сочетанного действия экстракта и циклофосфана на индукцию апоптоза (рисунок 2). 
При индивидуальном действии, в условиях однократного введения в среду культивирования, экстракт, независимо от использованной дозы, практически не является индуктором апоптоза (рисунок 2, А, Б, В). 
Инкубация клеток с экстрактом (50 и 100 мкг/мл, 1 час обработки) и последующее добавление циклофосфана (300 мкг/мл, 7 часов совместного действия) резко стимулирует апоптоз: количество апоптотических клеток в этих условиях возрастает примерно в 15 раз по сравнению с контролем (рисунок 2, Е, Ж). 
По-видимому, в этих условиях экстракт детерминирует способ-ность клеток к включению программы апоптотической гибели.
Таким образом, результаты, полученные в экспериментах с клетками HeLa, показали, что существует ярко выраженный синергизм действия экстракта и цитостатика циклофосфана на индукцию апоптоза, который особенно четко проявляется в усло-виях предварительной обработки клеток экстрактом (рисунок 2). 
Принципиально важно, что экстракт проявляет аналогичное синергетическое действие с цитостатиками доксорубицином и метотрексатом, которые широко используются в химиотерапии опухолей.
Доксорубицин - антибиотик антрациклинового ряда, выделен-ный из культуры Streptomyces peuceticus. Показано, что доксору-бицин интеркалирует в двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований и, как следствие, подавляет репликацию ДНК. Кроме того, доксорубицин является прооксидантом и индуцирует разрывы ДНК вследствие образования свободных радикалов. Помимо этого, противоопухолевое действие, возможно, обусловлено изменением клеточных функций в результате связывания с липидами клеточных мембран и взаимодействием с топоизомеразой II.
В концентрациях, принятых в практике химиотерапии, доксорубицин (0,01 и 0,001 мкг/мл) действует как эффективный блокатор клеточных делений (рисунок 4, В, Е). 
При индивидуальном действии доксорубицин в дозе, принятой в химиотерапии опухолей (0,001 мкг/мл), является эффективным индуктором апоптоза - количество апоптотических клеток в присутствии доксорубицина возрастает примерно в 10 раз (рисунок  5, В).
При сочетанном действии экстракта и доксорубицина (рисунок 4, Г, Д)   наблюдается полное ингибирование делений клеток.
Сочетанное действие экстракта (100 мкг/мл) и доксорубицина (0,01 мкг/мл) приводит к возрастанию доли апоптотических клеток примерно в 1,5 раза по сравнению с индивидуальным использованием доксорубицина (рисунок 5, Г). Увеличение дозы доксорубицина в 2 раза (0,02 мкг/мл) приводит к незначительному возрастанию доли апоптотических клеток по сравнению с дозой в 0,01 мкг/мл (рисунок 5, Д).
Таким образом, по сравнению с контролем или индивидуаль-ным действием экстракта, количество клеток, включивших программу апоптоза при сочетанном действии экстракта и доксорубицина, возрастает примерно в 20 раз.
Другой медицинский цитостатик - метотрексат, антагонист фолиевой кислоты, ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу, участвующую в восстановлении дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую кислоту (переносчик углеродных фрагментов, необходимых для синтеза пуриновых нуклеотидов и их произ-водных). В результате блокируется синтез ДНК и клетки перестают делиться. Особенно чувствительны к действию метотрексата активно пролиферирующие клетки злокачественных опухолей, костного мозга, эмбриональные клетки, эпителиальные клетки слизистых оболочек. Метотрексат является сильным иммунодепрессантом.
В концентрации, принятой в практике химиотерапии (4,3 мкг/мл), метотрексат действует как эффективный блокатор клеточных делений (рисунок 4, В, Е). 
При сочетанном действии экстракта и метотрексата (рисунок 4, Е, Ж)   наблюдается полное ингибирование делений клеток.
При индивидуальном действии метотрексат не является индуктором апоптоза (рисунок 5, Е).
При сочетанном действии с экстрактом метотрексат примерно в 4 раза повышает долю апоптотических клеток по сравнению с конт-ролем или его индивидуальным использованием (рисунок 5, Е, Ж).
Сочетанный эффект экстракта и цитостатиков проявляется не только на клетках HeLa, но и на трансформированных клетках миелоидного лейкоза, т.е. на моделях клеток как эпителиального, так и мезенхимного происхождения.
Исследования проводили на клетках миелоидного лейкоза, растущих в суспензионной культуре (рисунок 6). 
Для анализа индивидуального действия экстракта и доксорубицина клетки инкубировали 8 часов в нормальной среде, в среде, содержащей экстракт (100 мкг/мл) или доксорубицин (0,0002 мкг/мл), рисунки 8 -10.
Для анализа сочетанного действия реагентов клетки инкубировали 1 час в присутствии экстракта (100 мкг/мл), после чего добавляли в среду культивирования, содержащую экстракт, доксорубицин (0,0002 мкг/мл) и инкубировали клетки в течение 8 и 24 часов.
Полученные данные показывают, что индивидуальное применение экстракта в концентрации 100 мкг/мл не влияет на пролиферативную активность этого типа клеток (рисунок 6, Б),  тогда как доксорубицин в концентрации 0,0002 мкг/мл при индивидуальном и сочетанном с экстрактом действии практически полностью ингибирует деление (рисунок 6, В, Г). 
При индивидуальном действии экстракта и доксорубицина доля апоптотических клеток в популяции возрастает более чем в 20 и 40 раз соответственно (рисунок 6, Б, В).
Чрезвычайно эффективным индуктором апоптоза является сочетанное действие экстракта и доксорубицина. При таком применении доля апоптотических клеток миелоидного лейкоза возрастает в 90 раз (рисунок 6, Г). Важно, что использованная в данных экспериментах концентрация доксорубицина намного ниже рекомендованной для медицинского применения.

Цитотоксическое действие доксорубицина и доксорубицина в сочетании с экстрактом мицелия вешенки
Доксорубицин в концентрациях от 39,06 мкг/мл до 625 мкг/мл вызывает гибель 100% клеток уже через сутки после внесения препарата в культуру (острая цитотоксичность). ЦД50 для доксорубицина (гибель 50% клеток на третьи сутки после внесения в культуру клеток) составляет 9,8 мкг/мл.
Для определения сочетанного действия доксорубицина и экстракта готовили смеси доксорубицина в концентрациях от 625 мкг/мл до 1,2 мкг/мл с препаратом ЭМВ (экстракт мицелия вешенки) в концентрации 10 мг/мл и вносили их на монослой клеток Vero.
Результаты изучения комбинаций препаратов представлены на рисунке 11. Показано, что ЦД50 для смеси двух препаратов составляет 19,53 мкг/мл. Полученные результаты позволяют заключить, что препарат ЭМВ снижает цитотоксичность доксорубицина при воздействии на клетки Vero в 2 раза, задерживая развитие патологических изменений.
Таким образом, сочетанное действие экстракта и доксорубицина после дополнительных исследований можно рекомендовать для терапии некоторых форм лейкозов.
Полученные в работе данные позволяют высказать предпо-ложение, о том, что экстракт служит своеобразным «модулятором» физиологической активности клеток, каким-то образом способствуя активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза. В связи с изложенным, принципиально важно определить те клеточные мишени, которые подвергаются воздействию экстракта при его сочетанном использовании с цитостатиками.

 


Рисунок 1 - Индивидуальное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г -  контроль, 24 часа инкубации;
Д - экстракт (50 мкг/мл), 24 часа инкубации;
Е - экстракт (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;
Ж - экстракт 8 часов инкубации, отмывка от экстракта, 16 часов инкубации  в нормальной среде;
З - контроль, 8 часов инкубации; 
И - циклофосфан (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
К - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Л - контроль, 24 часа инкубации;
М - циклофосфан (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;
Н - циклофосфан (300 мкг/мл), 24 часа инкубации.


Рисунок  2 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на индукцию апоптоза (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт(50 мкг/мл);
В - экстракт (100 мкг/мл);
Г - циклофосфан (100 мкг/мл);
Д - циклофосфан (300 мкг/мл);  
Е - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление  циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Ж -  экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;   
З - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации ;
И - циклофосфан (300 мкг/мл); 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации. 


Рисунок 3 - Сочетанное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации ;
В - экстракт, (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации; 
Г - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации.


Рисунок 4 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие медицинских цитостатиков на пролиферацию (клетки HeLa)
А - контроль, 12 часов инкубации;
Б - экстракт (100 мкг/мл), 12 часов инкубации;
В - доксорубицин (0,01 мкг/мл), 12 часов инкубации;
Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,001 мкг/мл), 11 часов инкубации;
Д - экстракт (100 мкг/мл), добавление доксорубицина (0,02 мкг/мл), 11 часов инкубации;
Е - метотрексат (4,3 мкг/мл), 12 часов инкубации;
Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление метотрексата (4,3 мкг/мл), 11 часов инкубации;
З - 5-фторурацил (20 мкг/мл), 12 часов инкубации;
И - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление 5-фторурацила (20 мкг/мл), 11 часов инкубации.


Рисунок  5 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие медицинских цитостатиков на индукцию апоптоза (клетки HeLa)
А - контроль, 12 часов инкубации;
Б - экстракт (100 мкг/мл), 12 часов инкубации;
В - доксорубицин (0,001мкг/мл), 12 часов инкубации;
Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,01 мкг/мл) 11 часов инкубации;
Д - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,02 мкг/мл), 11 часов инкубации;
Е - метотрексат (4,3 мкг/мл),12 часов инкубации;
Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление метотрексата (4,3 мкг/мл), 11 часов инкубации;
З - 5-фторурацил (20 мкг/мл) 12 часов инкубации;
И - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление 5-фторурацила (20 мкг/мл), 11 часов инкубации.

Рисунок 6 - Индивидуальное и сочетанное с доксорубицином действие экстракта на пролиферацию и индукцию апоптоза (клетки миелоидного лейкоза)

А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - доксорубицин (1 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина  (1 мкг/мл), 7 часов инкубации.


Рисунок 7 - Индукция апоптоза в клетках HeLa последовательным действием низких и высоких доз экстракта
А - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Б - после 8 часов инкубации в присутствии экстракта в концентрации 50 мкг/мл добавлен экстракт в концентрации 100 мкг/мл, клетки инкубировались 16 часов.



Рисунок 8 - Действие низких доз доксорубицина на пролиферацию (клетки HeLa)
А - контроль;
Б - доксорубицин (0,00002 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - доксорубицин (0,0001), 8 часов инкубации;
Г - доксорубицин (0,002 мкг/мл), 8 часов инкубации.


Рисунок 9 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие низких доз доксорубицина на индукцию апоптоза (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - доксорубицин (0,00002 мкг/мл), 8 часов инкубации;
В - доксорубицин (0,0001 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Г - доксорубицин (0,002 мкг/мл), 8 часов инкубации;
Д - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,00002 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Е - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,0001 мкг/мл), 7 часов инкубации;
Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,002 мкг/мл), 7 часов инкубации.


Рисунок 10 - Сочетанное действие экстракта, циклофосфана и низких доз доксорубицина на индукцию апоптоза (клетки HeLa)
А - контроль, 8 часов инкубации;
Б - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,00002 мкг/мл), 7 часов инкубации;
В - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,0001 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.


Рисунок 11 - Снижение цитотоксичности доксорубицина при его сочетанном использовании с экстрактом (клетки Vero).



Рисунок 12 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосана на митотические хромосомы клеток  HeLa

А - контроль, метафаза;
Б - контроль, анафаза;
В - Г - действие экстракта, формирование микроядер и хромосом-ных абераций;
Д - Е - Ж - действие циклофосфана, неправильная сегрегация хромосом.



Рисунок 13  - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосана на индукцию апоптоза в клетках  HeLa
А - контроль;
Б - действие циклофосфана, микроядра;
В - действие экстракта, апоптоз;
Г - сочетанное действие экстрактаи циклофосфана, апоптоз.

Список литературы:  

1..Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии / Д. Б.   Корман - М.: Практическая медицина. -2006. - 503с.
2. Комбинированное и комплексное лечение рака легкого, молочной железы, пищевода и прямой кишки в условиях применения растительных адаптогенов и лазерного облучения крови: методические рекомендации. - Санкт-Петербург.: Министерство здравоохранения и медицинской промышленности РФ. - 1996. -14с.
3. Блохин Н.Н. Химиотерапия опухолевых заболеваний / Н.Н. Блохин, Н.И.  Переводчикова  - М.: Медицина. 1984. - 303 с.
4. Химиотерапия злокачественных новообразований / Под редакцией Э.Чу и В. Де Виты-младшего. - М.: Практика,  2008. -439 с.
5. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов/ Е.П.  Феофилова //Прикладная биохимия и микробиология. -1998, т.34, № 6, -С. 597-608.
6. Yang Q.Y., Jong S.C., Li X.Y., Zhou J.X., Chen R.T., Xu L.Z. Antitumor and immunomodulating activities of the polysaccharide-peptide (PSP) of Coriolusversicolor . J. Immunol Immunopharmacol 1992 a; 12: 29-34.
7. Wang H.X., Liu W.K., Ng T.B., Ooi V.E.C., Chang S.T. Immunomodulatory and antitumor activities of a polysaccharide-peptide cоmplex from mycelial culture of Tricholoma sp., a local edible mushroom. Life Sci. 1995;57: 269-81.
8. Collins R.A., Ng T.B. Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection. Life Sci. 1997;60: PL 383-87.
9. Wang H., Gao J., Ng T.B. A new lectin with highly potent antihepatoma and antisarcoma activities from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Sep 7; 275(3): 810-6
10. Brechtel R., Watzig H., Rudiger H. The lectin from mushroom Pleurotus ostreatus:  a phosphatase-activating protein that is closely associated with an alpha-galactosidase activity. A part of this paper has been presented as preliminary report at the 17th Interlec. Meeting 1997 in Wurzburg, Germany. Plant Sci. 2001 APR; 160(5): 1025-1033.
11. Shin H.H., Choi H.S. Purification and characterization of cysteine protease from Pleurotus ostreatus. Biosci Biotechnol Biochem. 1998; 62(7): 1416-8.
12. Герасименя В.П., Орлов А.Е. Камзолкина О. и др. Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotusostreatus 1137 для его получения. Патент РФ 2192873, 20.11.2002, Бюл. 32.
13. Gerasimenya V.P. Antimicrobial and antitoxical action of edible and medicinal mushroom Pleurotus ostreatus (Jacg.:Fr) Kumm. Extrasts. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2002. V. 4, pp. 127-132.
14. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotus ostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток / В.Ю.Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Журнал «Биологические мембраны».  -2007. Том 24. №5. -С. 379-388.