ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящих информационных материалах представлены результаты экспериментальных и клинических исследований по изучению возможности применения экстракта мицелия вешенки в комплексной терапии онкологических заболеваний с целью увеличения эффективности и снижения токсичности химиотерапии, а также в качестве радиопротектора при лучевой терапии.
Публикация предназначена для онкологов, радиологов, а также врачей других специальностей, занимающихся проблемами лечения опухолей.


Авторский коллектив:


Засл. деят. науки РФ, д-р техн. наук, проф. В.П. Герасименя,

академик, д-р мед. наук, проф. Д.А. Путырский,

д-р мед. наук, проф. З.Ш. Голевцова,

канд. техн. наук С.В. Захаров

д-р биол. наук, проф. Г.И. Кирьянов,

д-р биол. наук, проф. В.Ю. Поляков,

канд. техн. наук А.Е. Орлов,

канд. биол. наук Э.З. Рабинович,

канд. хим. наук А. В. Трезвова,

канд. биол. наук Л. М. Шаповалова


СОДЕРЖАНИЕ


ПРЕДИСЛОВИЕ
1. ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ МЕДИЦИНСКИХ ГРИБОВ -БАЗИДИОМИЦЕТОВ (СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА)
2. ПРЕДПОСЫЛКИ РАЗРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ (ЭМВ)
3. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭМВ
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭМВ НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
4.1. Изучение цитотоксического действия ЭМВ
4.2. Действие медицинских цитостатиков на деление клеток
и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa
4.2.1. Действие медицинских цитостатиков на деление трансформированных клеток
4.2.2. Действие медицинских цитостатиков на индукцию апоптоза
4.3. Действие ЭМВ на деление клеток и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa
4.3.1. Действие ЭМВ на деление клеток
4.3.2. Действие однократного введения ЭМВ на индукцию апоптоза
4.3.3. Действие двукратного введения низких и высоких доз ЭМВ на индукцию апоптоза («гемотерапия»)
4.4. Синергизм действия препарата ЭМВ и цитостатиков на деление и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa
4.4.1. Действие ЭМВ и цитостатиков на деление клеток
4.4.2. Действие ЭМВ и цитостатиков на индукцию апоптоза
4.5. Индивидуальное и сочетанное действие ЭМВ, доксирубицина и циклофосфана на клетки суспензионной культуры человеческого миелоидного лейкоза линии К-562
4.6. Анализ ex vivo влияния ЭМВ на выживаемость клеток острых лейкозов человека при его сочетанном действии с различными цитостатиками
4.7. Действие ЭМВ на культивируемые нормальные фибробласты человека
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ
5.1. Изучение антиметастатической активности ЭМВ
5..2. Изучение действия ЭМВ на биохимические показатели крови
мышей с экспериментальной карциномой легкого Льюиса
5.3. Изучение влияния ЭМВ на гематологические показатели периферической крови крыс после воздействия гамма-облучения
6 ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭМВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
6.1. Клиническая апробация препарата ОВО-Д у больных с лимфопролиферативными заболеваниями
6.2. Клиническая апробация препарата ОВО-Д у больных раком молочной железы 2-3А стадии
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРЕДИСЛОВИЕ
В информационных материалах представлены результаты экспериментальных и клинических исследований противоопухолевого действия стандартизованного экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на основе оригинального, запатентованного штамма гриба (Pleurotus ostreatus 1137) и препаратов на его основе.
Рассмотрен механизм действия ЭМВ, определены дозировки и схемы его применения в комплексной терапии больных с онкологическими заболеваниями.
Принципиально важные данные, показывающие уникальные свойства экстракта получены на модели культивируемых клеток. Показано, что экстракт в дозах, использованных во всех перечисленных в данных материалах исследованиях, не цитотоксичен для нормальных (не раковых) клеток. При однократном воздействии экстракт незначительно стимулирует пролиферативную активность, а при повторных воздействиях является сильно выраженным индуктором апоптоза. Экстракт обладает синергизмом действия с медицинскими цитостатиками (циклофосфаном, доксирубицином, даунорубицином, алексаном), применяемыми в химиотерапии опухолей. При сочетанном действии экстракта и перечисленных цитостатиков наблюдается значительное увеличению доли апоптических клеток в популяции. Важно, что в этих условиях эффективность действия цитостатиков значительно повышается, а их доза может быть значительно снижена. По-видимому, экстракт служит своеобразным «модулятором» физиологической активности трансформированных клеток, каким-то образом способствуя активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза.
В экспериментальных исследованиях, выполненных на мышах с привитой карциномой Льюиса, ЭМВ снижал интенсивность метастазирования, существенно повышал антиметастатический эффект циклофосфана, значительно увеличивал выживаемость, оказывал выраженное антитоксическое действие, нормализуя биохимические показатели крови.
При однократном и повторном облучении экспериментальных животных ЭМВ существенно снижал степень лейкопении у крыс, ускорял восстановление показателей крови и оказывал выраженное иммунопротекторное действие, что может служить основанием для выбора препаратов на его основе в качестве радиопротектора при проведении лучевой терапии онкологических больных.
В проведенных клинических исследованиях показано, что у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями (ХЛПЗ), получавших ЭМВ в комплексе с химиотерапией (ХТ), чаще развивалась ремиссия, не было прогрессирования заболевания, существенно снижались токсическое действие ХТ и частота осложнений. При комплексной терапии больных раком молочной железы 2-3А стадии показано, что приём ЭМВ существенно снижал частоту побочных эффектов ХТ, приводил к нормализации иммуно-регуляторных реакций, активации эффекторных звеньев иммунной системы, направленных на ликвидацию опухолевого процесса.
Экстракт мицелия вешенки является основой для производства лечебных препаратов с товарными названиями «ОВО-Д» и «ОВОДОРИН».
Полученные результаты обосновывают применение препаратов на основе экстракта мицелия вешенки в качестве модификаторов при ХТ больных онкологическими заболеваниями, повышающих эффективность и снижающих токсическое действие ХТ.

1. ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ МЕДИЦИНСКИХ ГРИБОВ - БАЗИДИОМИЦЕТОВ (СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА)
Исследованием лечебных свойств грибов - базидиомицетов и их практическим применением в медицине активно занимаются ученые ряда стран на протяжении многих лет.
Базидиомицеты обладают выраженными адаптогенными свойствами. В связи с важностью активных веществ из высших грибов для здоровья человека, в последние годы эти грибы называют медицинскими или лекарственными.
Медицинские грибы содержат полноценный комплекс биологически активных веществ: иммунномодулирующие и противоопухолевые полисахариды; коэнзим Q10 (убихинон) — необходимое вещество для работы сердца и печени; набор необходимых организму витаминов: бета-каротин, витамин Е, витамины группы В и др. В состав высших грибов входят незаменимые аминокислоты и питательные белки, большая группа ферментов, эссенциальные жирные кислоты и фосфолипиды, микроэлементы: калий, фосфор, кальций, железо, магний, цинк, селен, марганец, бор, кобальт и др.
Из высших грибов выделены и в ряде случаев идентифицированы вещества, которые проявляют гиполипидемические, кардиотонические, противоопухолевые, антивирусные, антибактериальные, гепатопротекторные, иммуномодулирующие свойства.
У лечебно-оздоровительных препаратов на основе медицинских грибов не выявлены побочные эффекты и токсическое действие.
В последние годы проявляется особый интерес к базидиальным грибам, как источникам новых эффективных и безопасных противоопухолевых природных веществ.
Противораковая активность обнаружена у активных веществ, выделенных из многих базидиомицетов (АВБ). По механизму действия АВБ, обладающие противораковой активностью, можно разделить на две основные группы. Первая объединяет вещества, непосредственно воздействующие на клетки злокачественных опухолей. Вторую группу составляют соединения, которые осуществляют лечебный эффект опосредованно, стимулируя противораковый иммунитет. К первой группе относятся синтезируемые базидиальными грибами гликаны, протеогликаны, терпеноиды, гаммапироны и др., способные подавлять развитие раковых клеток in vitro. Вторую группу составляют иммунотерапевтические агенты, чье противоопухолевое действие базируется на усилении иммунных ответов. Подавляющее большинство соединений этой группы представлено полисахаридами, основным компонентом которых являются 1-3-бета-О-гликаны. Описаны также эффективные иммуностимуляторы иной химической природы, например, коньюгаты полисахаридов, пектины, белки и другие пептиды.
Механизм иммунотерапевтического действия АВБ основан на усилении различных иммунных ответов, обычно подавленных у онкологических больных, и реализуется путём активации макрофагов, увеличения активности Т-клеток, повышения уровня сывороточных факторов, а также с помощью минорных эффектов, приводящих к уменьшению токсичности химиотерапевтических средств. Показано, что иммуностимулирующее действие активных веществ базидиомицетов обусловлено неспецифической индукцией синтеза интерферона и активацией NK клеток-киллеров. Антивирусная и канцеростатическая активности были выявлены у бета-О-глюканов, выделенных из плодовых тел и у водорастворимых лигно-гликопротеиновых комплексов, изолированных из автолизата глубинного мицелия.
Выявлены метаболиты базидиальных грибов с антиканцерогенной активностью, способные блокировать эффект ряда канцерогенов, в частности, N-бутил-1\1-бутанолнитрозоамина, а также обнаружено вещество с антимутагенной активностью, блокирующее образование N-нитрозосоединений. Выделены гуминоподобные биоантиоксиданты, обладающие выраженной антиканцерогенной активностью.
В ряде работ были предприняты попытки обобщить противораковые и иммуномодулирующие эффекты АВБ из различных высших базидиомицетов, выявить их общие структурные и физико-химические свойства, ответственные за эти эффекты. Так, ещё в 1999 г в обзоре [1] были проанализированы эффекты различных гликанов из базидиомицетов. Было показано, что 1-3-бета-О-гликаны, как в составе экстрактов, так и выделенные из них, в основном обеспечивают иммуномодулирующее и противоопухолевое действие. Однако, было отмечено, что, несмотря на структурную и функциональную схожесть гликанов из разных видов базидиомицетов, они различаются по эффективности действия на различные раковые опухоли и по способности индуцировать специфические клеточные реакции, в частности экспрессию и выработку цитокинов.
Специальное изучение противоопухолевых и иммуномодулирующих свойств полисахаридов из медицинских грибов (ПСГ) было выполнено в работе [2]. Было отмечено, что из 14000 известных видов грибов только незначительное число является источником новых перспективных фармацевтических веществ. Особенно важно для современной медицины, что эти виды представляют собой неограниченный источник уникальных веществ, обладающих противоопухолевым и иммуностимулирующим действием. Практически все базидиомицеты содержат большое количество биологически активных ПСГ в плодовых телах, но особенно высока их концентрация в мицелии. Эти ПСГ отличаются химической структурой, но все имеют 1 -3-бета-гликановые группы в главной цепи и дополнительные 1 -6-бета-гликановые группы в боковых цепях, которые необходимы для проявления их противоопухолевой активности. Для увеличения противораковой активности ПСГ перспективны различные методы химической модификации, в первую очередь, увеличивающие растворимость в воде и биодоступность.
В обзоре [3] обобщены противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства различных АВБ. Показано, что низкомолекулярные АВБ обладают прямым действием на опухолевые клетки: индуцируют в них апоптоз, подавляют ангиогенез и метастазирование. Высокомолекулярные полисахариды и полисахаропептиды стимулируют иммунные реакции, усиливающие противоопухолевую активность. Отмечена также выраженная противоопухолевая активность селеносодержащих комплексов, обнаруженных в базидиомицетах.
В одной из последних работ [4] на культуре колоректального рака (SW 480) была специально исследована антипролиферативная активность 2-х фракций, выделенных из экстракта гриба Ganoderma lucidum, препараты из которого традиционно используются в Китае и Японии в качестве противораковых средств. Фракция 1 содержала, в основном, полисахариды, а в состав фракции 2 входили только тритерпены. Было показано, что обе фракции существенно ингибируют пролиферацию клеток SW 480. При этом тритерпеновая фракция 2 оказывала большее антипролиферативное действие и, помимо этого, подавляла синтез ДНК и образование высокоактивных митогенных радикалов. В последние годы проведен ряд экспериментальных и клинических исследований, направленных на выявление механизмов антиканцерогенного и противоопухолевого действия веществ и препаратов, полученных из экстрактов плодовых тел и мицелия медицинских грибов. Эти исследования проведены в нескольких направлениях: оценка возможности монотерапии, увеличения эффективности и снижения токсичности противоопухолевой химиотерапии, а также ускорения реабилитации после химиотерапии.
В обзоре [5] представлены результаты многолетних наблюдений над репрезентативными выборками населения в Японии, в которых было показано, что длительное потребление продуктов из грибов существенно снижало частоту возникновения рака желудка. В работе [6] представлены данные о том, что частота смертности от рака среди фермеров, выращивающих древесные грибы и постоянно потребляющих их в пищу, существенно ниже, чем у других сельскохозяйственных рабочих.
В исследовании [7] на культуре клеток гормоно-резистентного рака простаты (CD-3) было выявлено дозозависимое цитотоксическое действие бета-гликана (БГ) из гриба Grifola frondoza (Мейтаки). При этом апоптоз индуцировался в 95% клеток при высоких дозах БГ. Комбинация с цитостатиком кармустином позволила достигнуть 95% апоптоза при существенном снижении дозы БГ и цитостатика. Сделан вывод, что бетагликан, даже в малых дозах, существенно сенсебилизирует раковые клетки к действию цитостатика, что позволяет рекомендовать его для комбинированной химиотерапии с целью снижения её доз и, соответственно, токсического действия.
В недавнем исследовании [8] была поставлена цель выяснить механизмы проапоптозного действия полисахаридов (ПСГ) из гриба Phellinus linteus и их комбинации с доксирубицином (ДР) на клетки гормоночувствительного рака простаты (LNCaP). Было показано, что ПСГ или ДР по отдельности в относительно низких дозах не индуцируют апоптоз в клетках опухоли. Однако, комбинация ПСГ и ДР в тех же низких дозах оказывает синергетический эффект, приводя к индукции апоптоза. При этом проапоптозное действие ПСГ реализуется путём активации клеточных каспаз. Авторы рекомендуют применение ПСГ в качестве модификаторов для повышения эффективности лекарственной терапии при раке простаты.
В работе [9] показано, что гликопротеин (ГП), выделенный из экстракта гриба Coriolus versicolor, увеличивает дозозависимо апоптоз клеток лейкемии человека HL-60 в комбинации с доксирубицином и этопозидом. При этом клеточный цикл прерывается в S-фазе, а эффект отмечается при сниженных, не токсичных дозах цитостатиков. Отмечается, что препарат из экстракта Coriolus versicolor применяется клинически с успехом в Китае в составе комбинированной химиотерапии лейкемии.
Способность индуцировать апоптоз в различных культурах раковых клеток обнаружена у компонентов экстракта из гриба Albatrellus confluens [10]. При этом выявлена важная роль митохондриального цитохрома С в активации каспаз и других факторов индукции апоптоза.
Противоопухолевое действие бета-(1 -6)-0:-гликана (БГ), выделенного из гриба A. blazei, было изучено ин-витро и ин-виво в работе [11]. Показано, что БГ оказывает выраженный цитотоксический эффект на клетки человеческой культуры рака яичника, блокируя их пролиферацию и индуцируя апоптоз, путём активации проапоптических белков и каспаз митохондриальным цитохромом С. Отмечено подавление роста метастаз в лёгких и брюшной области при оральном введении БГ мышам с привитыми опухолями рака яичников и ракалёгких. Авторы делают вывод о перспективности применения БГ из высших грибов для лечения больных с диссеминированным и метастатическим раком.
В настоящее время считается, что одним из важнейших механизмов противоопухолевого и антиметастатического действия различных веществ является их антиангиогенное действие. В работе [12] изучали влияние полисахаропептида (ПСП), выделенного из гриба Coriolus versico/огна ангиогенез в опухоли S180 у мышей. Было показано, что у мышей, получавших ПСП, плотность сосудов в опухоли была существенно меньше, чем в контроле. Этому соответствовало подавление экспрессии эндотелиального фактора роста и значительное уменьшение размера и массы опухоли. Сделан вывод, что подавление ангиогенеза является одним из важных механизмов противоопухолевого действия ПСП.
Важная роль активации иммунных реакций в обеспечении противоопухолевого действия бета-гликанов из медицинских грибов на организменном уровне была продемонстрирована в работе [13]. В эксперименте на животных с привитой карциномой было показано, что D-фракция бета-гликана (БГД) из плодовых тел гриба Grifola frondosa снижает повышенную активность В-клеток и потенцирует активацию Т - хелперов, усиливая клеточный компонент иммунной реакции. При этом индуцируется продукция у-интерферона, интерлейкинов IL-12 и IL-18, но подавляется продукция IL-4. Это сопровождается подавлением роста опухоли и метастазирования.
Особый интерес представляет исследование [14], в котором изучена возможность гемопоэтического действия 1,3-бета-0-гликана из гриба Sparassis crispa (БГС) на модели лейкопении у мышей, вызванной введением циклофосфана. Показано, что оральное введение БГС приводит к увеличению числа моноцитов, гранулоцитов и веса селезёнки по сравнению с контролем. Этот эффект усиливался при совместном применении с другими гемопоэти-ческими препаратами. Рекомендовано применение бета-гликанов для реабилитации онкологических больных после химиотерапии.
В обзоре [15] проанализированы противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства полисахаридов и полисахаридпептидных комплексов различных базидиомицетов. Отмечается сходство противоопухолевых и иммуномодулирующих механизмов действия этих веществ. Подчёркивается, что они индуцируют активность иммуномодулирующих цитокинов и их рецепторов, способствуя нормализации различных патологических состояний, в том числе при канцерогенезе.
Клинические исследования противоопухолевого действия экстрактов из базидиомицетов относительно ограничены.
В обзоре [16] обобщены результаты лечения больных различными видами рака (2-4 степени) препаратом, содержащим бета-1,6-гликан из гриба Мейтаки. Регресс опухолей и/или значительное улучшение симптомов наблюдали у 58,3 % больных раком печени, у 68,8 % больных раком молочной железы и у 62,5 % больных раком легких. В то же время улучшение отметили только у 10 - 20 % больных лейкемией, раком желудка и опухолями мозга. Применение препарата в комбинации с химиотерапией улучшало эффективность лечения в 1,2 - 1,4 раза. Кроме того, у этих больных отмечали существенно меньшее подавление иммунитета.
В работе [17] отмечается, что противоопухолевые препараты на основе полисахаридного (ПСК) и пептидно-полисахаридного (ПСП) комплексов из гриба Coriolus versicolor клинически более эффективны, чем препараты Лентинан (Lentinusedodes) и Сонифиллан (Schizophyllum commune). В клинических исследованиях, проведенных в Японии, начиная с 1970 г., было показано, что длительный приём ПСК существенно увеличивал 5-летнюю и более выживаемость больных раком пищевода, желудка, прямой кишки, гортани, лёгких и рака молочной железы. Клинические испытания 2 и 3 фаз лекарственного препарата на основе ПСП были выполнены в Китае. В этих рандомизированных исследованиях, проведенных под двойным слепым контролем, показано, что лечение ПСП значительно увеличивало 5-летнюю выживаемость больных раком пищевода. Кроме того, приём ПСП существенно улучшал качество жизни, обеспечивал стойкий обезболивающий эффект и повышал иммунный статусу 70-97% больных раком желудка, пищевода, лёгких, яичников и шейки матки. Было показано, что как ПСК, так и ПСП повышали количество иммунекомпетентных клеток, увеличивали инфильтрацию опухолей цитотоксичными Т-клетками и предотвращали развитие побочных эффектов химиотерапии. Отмечена хорошая переносимость препаратов, их совместимость с химио - и лучевой терапией.
Данные исследований коммерческого препарата Лингши на основе экстракта из гриба Ganoderma lucidum были обобщены в обзоре [18]. В исследованиях ин-витро было выявлено прямое цитостатическое и антиангиогенное действие препарата. В 2-х рандомизированных и 1-м не рандомизированном клинических исследованиях показано, что приём препарата улучшал качество жизни у 65 % больных раком и существенно повышал у них реакции клеточного иммунитета.
Несмотря на сходство противоопухолевых механизмов действия и однонаправленность эффектов АВБ из различных видов базидиомицетов, их активности значительно отличаются, как качественно, так и количественно. Поэтому в одной последних работ [19] было проведено сравнительное исследование противоопухолевой активности экстрактов из 20 видов наиболее известных базидиомицетов на культуре клеток гормоно-резистентного рака простаты (РС-3). Показано, что водорастворимый экстракт из гриба Pleurotus ostreatus - вешенка (РОЭ) оказывал наиболее выраженное цитостатическое действие на опухолевые клетки по сравнению с экстрактами из всех ос­тальных видов грибов. При этом РОЭ быстро индуцировал апоптоз в клетках опухоли РС-3 при концентрации 150 мкг/мл и экспозиции в течение 2 часов. Экспозиция опухолевых клеток в течение 6 часов с РОЭ в концентрации 200 мкг/мл приводила к разрыву участков ДНК и полной остановке клеточного деления. При этом как цитотоксическое действие, так и способность индуцировать апоптоз были дозозависимыми. Было показано, что колонийобразующая способность опухолевых клеток снижалась от 100 % до 4,5 % и 0,5 % при концентрациях РОЭ, равных 60 мкг/мл и 120 мкг/мл, соответственно. Противоопухолевая активность РОЭ существенно зависела от температуры в процессе экстракции: она полностью исчезала при экспозиции в течение 2 часов при температуре 80 С° и сохранялась при длительной экспозиции при температуре 40 С. Была идентифицирована наиболее активная фракция экс­тракта Pleurotus ostreatus - РОЭ-Ф2, также чувствительная к тепловой обработке. Полученные данные, а также анализ физико-химических характерис­тик РОЭ-Ф2 позволил предположить, что активным компонентом экстракта Pleurotus ostreatus является водорастворимый полипептид.
В исследовании [20], проведенном на мышах, было выявлено протекторное действие экстракта Pleurotus ostreatus (ЭПО) на индукцию карциномы мочевого пузыря в ответ на введение карциногена (N-butyl-N'-butanolnitrosoamine). При этом показано, что активность макрофагов, лейкоцитов и цитотоксическая реакция NK лимфоцитов против опухолевых клеток были подавлены у мышей, получавших только канцероген. С другой стороны, у мышей, получавших канцероген и ЭПО, активность этих клеток ос­тавалась на уровне нормы.
В работе [21]изучали протекторное действие высушенного порошка Pleurotus ostreatus (ППО) на рак прямой кишки, индуцированный введением карциногена dimethylhydrazine (DMH), у крыс самцов. Введение ППО совместно с DMH приводило к значительному снижению числа опухолей, гиперпла-зированных лимфоузлов и атипичных клеток. При этом отмечено подавление активности тканевых онкомаркёров в прямой кишке и печени.
Влияние экстракта Pleurotus ostreatus (ЭПО) на апоптоз, пролиферативный клеточно-ядерный антиген (ПКЯА) и белок р53 исследовано при индук­ции рака прямой кишки у крыс канцерогеном - dimethylhydrazine (DMH). Введение ЭПО совместно с DMH приводило к существенному снижению частоты возникновения раковых опухолей. При этом у крыс, получавших корм с ЭПО, отмечено существенное повышение в тканях индекса апоптоза, содержания р53 и снижение ПКЯА [22].
Исследования, проведенные в последние годы, были посвящены изучению механизмов противоопухолевого действия экстрактов из Pleurotus ostreatus, а также идентификации активных веществ, вызывающих этот эффект.
В работе [23] изучали антипролиферативное и проапоптическое действие водорастворимой фракции экстракта из глубиннокультивируемого мицелия Pleurotus ostreatus (ЭМПО) на культуре клеток НТ-29 рака прямой кишки. Показано, что ЭМПО подавлял дозозависимо пролиферацию опухолевых клеток вследствие индукции в нихапоптоза. При этом выявили активацию проапоптозного белка Вахи цитозольного цитохрома-с. Был выделен и охаракте­ризован основной активный компонент ЭМПО в виде низкомолекулярного полисахарида альфа-гликана. Сделан вывод, что основным механизмом антипролиферативного действия ЭМПО является индукция программируемой смерти в опухолевых клетках.
В другом исследовании [24] было обнаружено противоопухолевое и иммуномодулирующее действие ЭМПО, содержащего три нейтральных фракции протеогликанов, отличающихся соотношением полисахарид/белок: 14,2; 18,3 и 26,4, соответственно. Эти фракции тестировали инвиво на мышах с привитой опухолью (Sarcoma-180). Было выявлено выраженное противоопухолевое действие всех фракций ЭМПО, заключающееся в существенном снижении числа опухолевых клеток. Показано, что у большинства клеток опухоли цикл деления прерывался в пре-С(0)/(С1)фазе. Все три фракции существенно увеличивали цитотоксическое действие NK клеток и стимулировали выработку N0 макрофагами. Было рекомендовано применение ЭМПО в качестве противоопухолевого и иммуномодулирующего комплекса.
В работе [25] исследовали противоопухолевое действие высокомолекулярного лектина с молекулярным весом 40-41 кДа, выделенного из плодовых тел гриба Pleurotus ostreatus (ЛПО). Выявлено потенциальное противоопу­холевое действие ЛПО на мышах с привитыми опухолями (саркома S-180 и гепатома Н-22). Однако, ЛПО обладал существенным гемагглютенирующим действием.
В отдельном исследовании [26] было показано иммуномодулирущее и противоопухолевое действие ДНК, выделенной из плодовых тел гриба Pleurotus ostreatus (ДПО). Введение ДПО мышам с привитой саркомой Эр-лиха приводило к существенному увеличению их выживаемости. При этом отмечали выраженное повышение цитотоксической активности NK клеток.
Выше были рассмотрены примеры противоопухолевых эффектов водных экстрактов из плодовых тел и мицелиев грибов или выделенных из них b-гликанов и лектинов. Значительно меньше информации об экстрактах другого вида. На практике применяются два полярных подхода к получению экстрактов. В первом из них экстрагирование ведется в водных средах при варьировании рН. В этом варианте в экстракт переходят полимерные вещества - белки и полисахариды (b-гликаны, пищевые некрахмалистые волокна).
Вторая схема экстрагирования заключается в использовании различных органических растворителей, как экстрагентов: этанола, метанола, этилацетата и т. д. В этом случае ни белки, ни полисахариды в экстракт не переходят. Следо­вательно, действующее начало в таких экстрактах принадлежит широкому спек­тру низкомолекулярных соединений, часть из которых идентифицирована.
Так, антиоксидантной и гиполипидемической активностью обладают метанольные и этилацетатные экстракты из P. Citrinoplleatus [27]. Большинство антиоксидантных веществ базидиомицетов переходят в метанольный экс­тракт [31]. Главными компонентами таких экстрактов являются эргостерины и никотиновая кислота. Эти же экстракты оказывают ингибирующий эффект на тумор-индуцированную неоваскуляризацию и блокирование иммунного подавления, индуцированного опухолью [28].
Из Ganoderma lucidom выделены производные стильбена - ресвератрол и его димер - каззиагрол, которые обладают антиметастатической активностью [29]. Антираковыми эффектами обладают фракции полифенолов [30]. Эллаготаннины и гидролизируемые танины в экстрактах органических растворителей из базидиомицетов ингибируют туморогенез, например, почек у CD-1 мышей [32].
Сравнение водных и этанольных экстрактов гриба Ganoderma lucidus показало, что оба эктракта индуцируют апоптоз в MCF-7 - линии раковых клеток. Такие же антираковые свойства наблюдали у водной фракции, переосаж­денной этанолом.
В целом, по-видимому, ясно, что круг наиболее активных соединений из базидиомицетов достаточно широк. Антираковые эффекты на клеточном уровне, по-видимому, опосредуются индукцией апоптоза, однако, мишени для разных экстрактов могут быть различными.
Нельзя исключить и возможность сложного экспериментального артефакта, трактуемого как «синергизм» действия разнонаправленных биологически активных соединений. В этой связи любопытен пример с эпикатехином. Этот представитель классатаннинов эффективен против диабета и ряда опухолей. Таннины известны в качестве активных комплексообразователей. В клетках (и, по-видимому, в водных лизатах) они эффективно связываются с белками и полисахаридами, используя различные варианты связей:

  1. водородные связи между фенольными гидроксильными группами таннинов и свободными аминокислотами белков, или гидроксильными и кар боксильными группами полисахаридов;
  2. ионные связи между анионными группами таннинов и катионными группа ми белков;
  3. смешанные соли с другими полимерами с участием ионов двухвалентных металлов (Са2+);
  4. ковалентными связями через хиноновые группы таннинов и соответству ющие группы в молекулах полимеров.

В целом, это может снять противоречие между данными о свойствах водных и спиртовых экстрактов. В этом смысле, в водных экстрактах мы наблюдаем синергизм эффектов двух и более агентов.
Таким образом, анализ данных литературы позволяет представить основной механизм противоопухолевого действия активных веществ из медицинских грибов, заключающийся как в прямом цитотоксическом действии на клетки опухоли, в том числе за счёт индукции апоптоза, так и опосредованно путём стимуляции противоопухолевого иммунитета.

2.     ПРЕДПОСЫЛКИ РАЗРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ
В настоящее время в качестве лечебно-оздоровительных средств и биологически активных добавок внедрен ряд препаратов, полученных в основном из плодовых тел грибов Lentinus edodes (лентинан, Япония), Inonotusobllguus (бефунгин, Россия), Agaricus blazei( США), Schizophyllum commune (сонифи-лан, Япония), «Мипро-ВИТ» (РФ), Fusarium sambucinum Fuskel var.ossicolum bilai (РФ), «Микотон» (Украина), «Трамелан» (РФ).
В настоящее время, в связи с развитием биотехнологических методов культивирования базидиальных грибов, становится возможным создание современной индустриальной отрасли, занимающейся производством экологически безопасных, биологически активных веществ и лекарственных препаратов из мицелия и вегетативной биомассы. Как было показано в ряде исследований [19; 23; 24], для этих целей наиболее перспективным является гриб Pleurotus ostreatus.
Под руководством профессора Герасименя В.П. разработана и запатентована оригинальная технология получения экстракта мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus) (патент РФ №2192873 от 20.01.2003 г.).
При лечении онкологических заболеваний широко применяется противоопухолевая химиотерапия с использованием целого ряда цитостатиков.
Между тем, существенным ограничением в достижении максимальной эффективности противоопухолевой химиотерапии является высокая токсичность цитостатиков. Именно токсические проявления противоопухолевых препаратов, в первую очередь, гематологическая токсичность, ограничивают проведение адекватного лечения. В ряде случаев химиотерапия проводится сниженными дозами лекарств с увеличением интервалов между курсами и, как результат, лечение бывает неудовлетворительным.
Именно поэтому проводится активный поиск и разработка новых препаратов, с целью снижения токсического действия и повышения эффективности комбинированной противоопухолевой терапии.
В настоящих информационных материалах представлены результаты экспериментальных (доклинических) и клинических исследований по изучению возможности применения препаратов на основе экстракта мицелия вешенки в комплексной терапии онкологических заболеваний с целью увеличения эффективности и снижения токсичности базовой химиотерапии.
3.    ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ
Экстракт представляет собой экстракт в виде геля коричневого цвета с приятным травянисто-медовым вкусом и ореховым запахом, получаемый из экстракта вешенки, культивируемого в регулируемых асептических условиях нажидкой питательной среде при интенсивном аэрировании
Экстракт мицелия вешенки имеет следующий состав:

  1. углеводы (глюкоза, галактоза, манноза, арабиноза, ксилоза, галактоза, глюкозамин),
  2. аминокислоты (аспаргин, серин, треонин, глютамин, пролин, глицин, аланин, валин, лейцин, лизин, гистидин, аргинин, цистин, метионин, тирозин, фенилаланин),
  3. жирные кислоты (С10-С22),
  4. органические кислоты (масляная, молочная, уксусная, яблочная, щавелевая),
  5. витамины (В1, В2, В3, В6, PR D, E, С),
  6. металлы и микроэлементы (натрий, калий, кальций, магний, фосфор, сера, железо, цинк, марганец, селен, медь, алюминий, бор, барий, крем ний, литий и др.),
  7. вода.

Все эти вещества находятся в природных, естественных соотношениях, что, в значительной степени, определяет высокую биологическую активность экстракта.
Экстракт является основой для производства трех лечебных препаратов для приема внутрь:

ОВОДОРИН (гель) (ООО «Инбиофарм»). Экстракт расфасован по 50 мг и 100 мг в стеклянные флаконы, по 10 флаконов в упаковке. Гель перед употреблением разводят в 100 мл кипяченой воды, охлажденной до комнатной температуры. (Св.Гос. регистрации 77.99.23.У.10520.12.08 от 11.12.2008 г.)

ОВОДОРИН (сироп ) (ООО «Инбиофарм»). Сироп расфасован по 80 мл в стеклянные флаконы с мерной ложкой. Содержит ЭМВ, дигидрокверцетин, фруктозу, пищевой стабилизатор и воду. Сироп перед употреблением в количестве 4 мл (содержит 50 мг геля) или 8 мл ( содержит 100мг геля) разводят в 100мл кипяченой воды, охлажденной до комнатной температуры. (Св.Гос. регистрации 77.99.23.У.11103.12.08 от 22.12.2008 г.)

ОВО-Д (сироп) (ООО НПК «Пульмомед»). Сироп расфасован по 80 мл в стеклянные флаконы с мерной ложкой. Содержит ЭМВ, фруктозу, пищевой стабилизатор и воду. Сироп перед употреблением в количестве 4 мл (содержит 50 мг геля) или 8 мл (содержит 100 мг геля) разводят в 100 мл кипяченой воды, охлажденной до комнатной температуры. (Св. Гос.регистрации № 77.99.23.3.У.1380.3.07 от 06.03.2007 г.)


4.     ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭМВ НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

Исследования проводились учеными и специалистами испытательного лабораторного центра «Универсальная аналитическая лаборатория» ООО ИЛЦ «Универсал» (г. Москва).

4.1.   Изучение цитотоксического действия ЭМВ
В качестве объекта для проверки цитотоксичности экстракта мицелия вешенки использовали перевиваемые клетки почки зеленой мартышки (Vero). Клетки этой культуры не являются раковыми и их разрешено использовать для приготовления вакцин. ЭМВ в различных концентрациях (5000, 2500, 1000, 500 и 100 мкг/мл) вносили в среду культивирования клеток Vero. Проведенные исследования показали, что в течение 7дней наблюдений в концентрациях 1000, 500 и 100мкг/мл экстракт не вызывал видимых цитопатических изменений как монослоя, так и индивидуальных клеток Уего.Четко тестируемые изменения морфологии у 50% клеток происходят при концентрации ЭМВ 2500 мкг/мл. Таким образом, ЦД50 для данной культуры клеток составляет 2500 мкг/мл. Из полученных данных следует, что для экспериментального и практического применения экстракта мицелия вешенки целесообразно использовать концентрации, не превышающие 2000 мкг/мл.

4.2. Действие медицинских цитостатиков на деление клеток и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa
В эксперименте использовали цитостатики - циклофосфан , доксирубицин, метатрексат и 5-фторурацил, широко применяемые в онкологической практике. Определение дозы реагентов осуществляли на основании клинических рекомендаций, в пересчете на 1 мл среды культивирования: циклофосфан - 300 мкг/мл, доксирубицин - 0,01 мкг/мл, метатрексат - 4 мкг/мл, 5-фторурацил - 20 мкг/мл.


4.2.1. ДЕЙСТВИЕ МЕДИЦИНСКИХ ЦИТОСТАТИКОВ НАДЕЛЕНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК
Клетки HeLa инкубировали в присутствии цитостатиков в течение 24 час. Для количественной оценки действия препарата определяли митотический индекс (количество митозов на 10ОО изученных клеток).
Все использованные цитостатики являются ингибиторами клеточного деления. Наиболее активны в этом отношении доксирубицин и метатрексат, которые на 90 - 95% ингибируют митотическую активность клеток.
Циклофосфан в дозе 100 и 300 мкг/мл незначительно увеличивает митотический индекс, при этом возрастает доля патологических митозов на стадиях метафазы и анафазы.

4.2.2. ДЕЙСТВИЕ МЕДИЦИНСКИХ ЦИТОСТАТИКОВ НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА

Клетки инкубировали в присутствии цитостатиков в течение 8час, т.е. то время, за которое в части культивируемых клеток полностью реализуется программа апоптоза. Апоптические клетки тестировали по характерной структуре ядер и по наличию в цитоплазме свободного цитохрома С. Для количественной оценки действия препарата определяли «апоптический индекс» - доля клеток с признаками апоптической гибели в 1000 изученных клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что все использованные цитостатики являются индукторами апоптической гибели клеток, однако, эф­фективность их действия существенно различается.
Циклофосфан: является слабым индуктором апоптоза. 5-фторурацил: доля апоптических клеток в присутствии 5-фторурацила возрастает примерно в 2 раза. Метатрексат: доля апоптических клеток в присутствии метатрекса-та возрастает в 3,6 раза по сравнению с контролем. Доксирубицин: является наиболее эффективным индуктором апоптоза. При использовании концентраций доксирубицина, принятых в клинической практике (0,01 мкг/мл), доля апоптических клеток возрастаете 10 раз. Испытание действия низких доз доксирубицина показало, что как индуктор апоптоза он сохраняет высокую эффективность при значительном снижении концентрации. В дозе 0,00002 и 0,0001 мкг/мл количество апоптических клеток возрастает примерно в 5 раз. Наиболее эффективна доза доксирубицина 0,002 мкг/мл. В этих условиях доля апоптических клеток в 12 раз превышает контрольные показатели.

4.3. Действие ЭМВ на деление клеток и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa

4.3.1. ДЕЙСТВИЕ ЭМВ НАДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Определение доли делящихся клеток (митотического индекса) в контрольных клетках и клетках, обработанных ЭМВ, показывает, что экстракт в дозе 50 мкг/мл и 100 мкг/мл незначительно увеличивает митотический индекс через 24 часа обработки за счет возрастания доли митозов на стадии метафазы и телофазы.
Появление характерных хромосомных аберраций в клетках, обработанных экстрактом, свидетельствует о том, что одной из возможных мишеней его действия является ДНК.

4.3.2. ДЕЙСТВИЕ ОДНОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ ЭМВ НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА
В условиях однократного введения экстракта мицелия вешенки в среду культивирования, он практически не является индуктором апоптоза.

4.3.3. ДЕЙСТВИЕ ДВУКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ НИЗКИХ И ВЫСОКИХ ДОЗ ЭМВ НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА («ГОМОТЕРАПИЯ»)
После 3 дней культивирования в среду добавляли экстракт в концентрации 50мкг/мл на 8часов , а затем экстракт в концентрации 100 мкг/мл. После повторного введения ЭМВ клетки инкубировали 16 час.
Полученные результаты показывают, что использованный протокол воздействия повышает долю апоптических клеток в популяции примерно в 15 раз, что значительно превышает эффект действия ЭМВ в сочетании с циклофосфаном (см. п. 4.4).

4.4. Синергизм действия ЭМВ и цитостатиков на деление и индукцию апоптоза в трансформированных клетках HeLa

4.4.1. ДЕЙСТВИЕ ЭМВ И ЦИТОСТАТИКОВ НАДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Ярко выраженное действие на пролиферацию клеток экстракт проявляет при сочетанном использовании с митостатиками - циклофосфаном, доксирубицином и метатрексатом.
Циклофосфан. При концентрации ЭМВ в дозе 50 мкг/мл и циклофосфа-на 300 мкг/мл не наблюдается подавления пролиферации. Однако, при повышении концентрации ЭМВ до 100 мкг/мл и концентрации циклофосфана до 300 мкг/мл пролиферация подавляется.
Доксирубицин. метотрексат. 5-фторурацил. При сочетанном действии экстракта мицелия вешенки и цитостатиков в указанных выше дозах наблюдается полное ингибирование митозов.

4.4.2. ДЕЙСТВИЕ ЭМВ И ЦИТОСТАТИКОВ НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА
Анализ различных режимов воздействия препаратами показывает, что для индукции апоптоза наиболее эффективна предварительная обработка клеток экстрактом (1 час) с последующим введением цитостатиков (7 час). При этом эффективность действия ЭМВ существенно зависит от типа цитостатика.
Циклофосфан. Инкубация клеток с экстрактом (50 и 100 мкг/мл, 1 час обработки) и последующее добавление циклофосфана (ЗООмкг /мл, 8 часов совместного действия) резко стимулирует апоптоз (количество апопти-ческих клеток в этих условиях возрастает примерно в 5 - 6раз по сравнению с контролем).
Доксирубицин. При сочетанном действии с ЭМВ доля апоптических клеток повышается в 1,5-2 раза по сравнению с использованием только доксирубицина. Это означает, что по сравнению с контролем количество клеток, включивших программу апоптоза, возрастает примерно в 25 раз.
Метатрексат, При сочетанном действии с ЭМВ метатрексат примерно в 4 раза повышает долю апоптических клеток по сравнению с его индивидуальным использованием.
На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что ЭМВ детерминирует переход клеток в «предапоптическое» состояние. В этом случае, последующая обработка цитостатиками циклофосфаном, док-сирубицином и метатрексатом приводит к включению программы апоптоза.

4.5.   Индивидуальное и сочетанное действие ЭМВ, доксирубицина и циклофосфана на клетки суспензионной культуры человеческого миелоидного лейкоза линии К-562.
Исследования проводили на клетках миелоидного лейкоза, растущих в суспензионной культуре. Клетки инкубировали 1 чаев присутствии экстракта (100 мкг/мл), после чего добавляли в среду культивирования, содержащую ЭМВ, доксирубицин (0,0002 мкг/мл), циклофосфан (300 мкг/мл) и инкубировали клетки в течение 8 и 24часов . В качестве контроля клетки инкубировали в присутствии ЭМВ и доксирубицина в тех же концентрациях.
Полученные данные показывают, что при раздельном воздействии ЭМВ и доксирубицин незначительно повышают количество апоптических клеток (до 6 и 12%, соответственно). Воздействие циклофосфана не вызывает увеличения количества апоптических клеток по сравнению с контролем.
Использование смеси реагентов в течение 8 час значительно эффективнее индуцирует апоптоз в лейкозных клетках (27%).
Более сильная стимуляция апоптоза наблюдается, если клетки в смеси реагентов инкубировать 24 часа. При такой постановке эксперимента в апоптоз вступают около 70% клеток исследуемой популяции.
Таким образом, сочетанное действие ЭМВ, доксирубицина и циклофосфана, после дополнительных исследований, может быть использовано для терапии некоторых форм лейкозов. Важно, что концентрация доксирубицина, использованная в данных экспериментах, намного ниже дозы, рекомендованной для медицинского применения.

4.6.       Анализ ex vivo влияния ЭМВ на выживаемость клеток острых лейкозов человека при его сочетанном действии с различными цитостатиками.
Для проверки влияния ЭМВ в сочетанном действии с различными цитостатиками на изменение количества клеток острых лейкозов человека (ОЛ) проведены 2 серии экспериментов с определением выживаемости клеток в 48-часовой культуре.
1. Клетки костного мозга пациентов с диагнозом ОЛ выделялись и культивировались в течение двух суток в присутствии цитостатиков (алексана и даунорубицина). Определение количества живых клеток проводилось через 48 часов в камере Горяева и автоматическом гемоцитометре.
По результатам 4 опытов в присутствии алексана через 48 час выживает 24% клеток, а в случае даунорубицина - 30%.
2.    К культивируемым клеткам добавляли ЭМВ в концентрации 100 мкг/мл на 1 час, а, затем, даунорубицин и алексан. По результатам 4 опытов через 48 час. инкубации в присутствии ЭМВ и алексана выживает 10% клеток, а в присутствии ЭМВ и даунорубицина - 5% клеток.
Данные проведенных экспериментов позволяют говорить о выраженном цитостатическом действии экстракта мицелия вешенки на клетки костного мозга у пациентов, страдающих ОЛ.

4.7.     Действие препарата ЭМВ на культивируемые нормальные фибро бласты человека.
Раздельное или сочетанное действие на нормальные фибробласты человека циклофосфана и ЭМВ не приводит к индукции апоптической гибели клеток.
Сочетанная обработка по протоколу, предусматривающему предварительную инкубацию клеток с циклофосфаном в дозе 300 мкг/мл (1час), а затем добавление экстракта в дозах 50 или 100 мкг/мл и инкубацию до 8 час, приводит к повышению числа клеток, вступающих в деление. Количественный анализ показал, что митотический индекс возрастает примерно в три раза. Количество апоптических клеток при этом не изменяется по сравнению с контролем.
Сочетанная обработка по протоколу, предусматривающему предварительную инкубацию клеток с ЭМВ в дозе 50мкг/мл (1 час), а затем добавление циклофосфана в дозе 300 мкг/мл (1час) и инкубацию до 8 час, приводит к более значительному повышению числа клеток, вступивших в деление. Количественный анализ показал, что митотический индекс при этом возрастает примерно в 4 - 5 раз, а число апоптических клеток уменьшается примерно в 3 раза.
Сочетанная обработка клеток при одновременном введении циклофосфана и ЭМВ, практически, не влияет на пролиферацию.
На основании проведенных исследований можно сделать предварительное заключение о том, что клеточный ответ трансформированных и нормальных клеток на индивидуальное и сочетанное действие экстракта мицелия вешенки и циклофосфана принципиально различается. В трансформированных клетках эти реагенты при определенном соотношении и методе введения способны индуцировать апоптическую гибель клеток, тогда как их действие на нормальные клетки ограничивается эффектом, показывающим только стимуляцию пролиферации.

Выводы:

  1. Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что экстракт мицелия вешенки при последовательном использовании низких и высоких концентраций является ярко выраженным индуктором апоптоза.
  2. ЭМВ обладает синергизмом действия с цитостатиками (циклофосфа ном, доксирубицином, даунорубицином, алексаном), применяемыми в химиотерапии опухолей. Предварительная инкубация клеток лейкоза человека с ЭМВ и последующее добавление к среде культивирования цитостатиков приводит к значительному увеличению доли апоптических клеток в популяции. Важно, что в этих условиях эффективность действия доксирубицина значительно повышается, а его доза может быть значительно снижена. По-видимому, ЭМВ служит своеобразным «модулятором» физиологической активности клеток и, каким-то образом, способствует активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза.

Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что препараты на основе экстракта мицелия вешенки в комплексной терапии онкологических заболеваний способен приводить к гибели опухолевых клеток и проявлять защитные свойства в отношении нормальных клеток.


5.     ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ

5.1.  Изучение антиметастатической активности ЭМВ
Метастазирование опухолей является одним из ключевых признаков ее злокачественности. Именно раннее метастазирование лимитирует эффективность всех известных способов лечения опухоли (хирургическое удаление, химио- и лучевая терапия и др.)
В ОАО «ВНЦ БАВ» (Старая Купавна, Россия) проводили эксперименты на мышах самках (СВАХ С 57В16) F1. Спонтанно метастазирующую карциному Льюиса (LLC) трансплантировали в мышцу бедра задней лапы живот­ных. Наблюдения проводили по 3 группам животных: контрольная группа, группа животных, получавших только ЭМВ в дозе 100мг /кг, и группа, получавшая ЭМВ в дозе 100мг /кг в комбинации с циклофосфаном в дозе 100 мг /кг. ЭМВ вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг /кг массы животного, начиная со вторых суток после трансплантации опухоли. Введение прекращали за сутки до окончания эксперимента. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг 1 раз в неделю, начиная с 5 суток после трансплантации опухоли. На 23 сутки после трансплантации опухоли определяли массу легких с метастазами и количество метастати­ческих узлов в легких.
В отсутствие циклофосфана ЭМВ в дозе 100мг/кг не оказывал существенного влияния на рост первичной опухоли, но ингибировал интенсивность матастазирования, уменьшая число метастазов в легких на 38% и массу метастатических узлов на 68%.
В комбинации с циклофосфаном масса метастатических узлов уменьшалась на 94%.
Таким образом, при экспериментальной карциноме Льюиса экстракт мицелия вешенки оказывает выраженное антиметастатическое действие и существенно усиливает антиметастатическое действие циклофосфана.


5. 2. Изучение действия ЭМВ на биохимические показатели крови мышей с экспериментальной карциномой легкого Льюиса/
Влияние ЭМВ, циклофосфана и их комбинации на биохимические показатели сыворотки экспериментальных животных оценивали по активности аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), а-амилазы и содержанию общего белка, общего билирубина, креатинина, холестерина, триглицеридов и глюкозы.
Наблюдения проводили по следующим группам: группа интактных животных; группа контрольных животных; группа, получавшая ЭМВ в количестве 100 мг/кг; группа, получавшая циклофосфан в дозе 100 мг/кг и группа, получавшая ЭМВ (100 мг/кг) и циклофосфан (100 мг/кг).
В контрольной группе животных через 23 дня трансплантации карциномы легкого Льюиса отмечался рост активностей трансаминаз (АсАТ- в 2,7 раза, АсАТ- в 13,8 раз), снижение активности ЩФ в 7,6раз, концентрация белка снизилась по сравнению с нормой на 20%, креатинина на 60%, глюкозы на 35%. Наблюдалась выраженная гипертриглицеридемия: содержание триглицеридов составило 3,76 ммоль/л по сравнению с величиной 1,97 ммоль/л у группы интактных животных. Активность а-амилазы не отличалась от показателя у интактных животных.
В группе животных, получавших экстракт в дозе 100 мг /кг, наблюдалось достоверное снижение уровня триглицеридов и тенденция к нормализации содержания общего белка, тогда как остальные показатели соот­ветствовали величинам, полученным для контрольной группы животных.
Циклофосфан в дозе 100 мг/кг, по сравнению с контрольной группой, способствовал ингибированию а-амилазы.
При сочетанном применении циклофосфана в дозе 100 мг/кг и ЭМВ в такой же дозе активность а-амилазы повысилась до показателей нормы.
Таким образом, использование ЭМВ в комбинированной терапии с циклофосфаном обеспечивает поддержание активности а-амилазы на уровне нормы и регулирует уровень триглицеридов и общего белка в сы­воротке крови мышей с экспериментальной карциномой легкого Льюиса.
В эксперименте, аналогичном описанному выше, было изучено влияние различных доз ЭМВ (без циклофосфана) на биохимические показатели сыворотки крови мышей при курсовом введении препарата в течение 23 дней.
Введение ЭМВ в дозе 200 мг/кг замедлило развитие цитолиза: достоверно уменьшилась активность АлАТ и появилась тенденция к снижению ак­тивности АсАТ, повысились активности ЩФ и а- амилазы, хотя их величины остались ниже показателя нормы. Уровень глюкозы в 2 раза превысил показатель контрольной группы.
При повышении доз ЭМВ до 300, 500 и 1000мг/кг только уровень глюкозы стабильно повышался, в то время как остальные показатели оставались практически неизменными по сравнению с показателями группы животных, получавших экстракт в дозе 200 мг/кг.
Таким образом, при экспериментальной карциноме Льюиса экстракт мицелия вешенки оказывает гепатопротекторное действие, замедляя развитие цитолиза и нормализуя белковый и углеводный обмен.

5.3. Изучение влияния ЭМВ на гематологические показатели периферической крови крыс после воздействия гамма-облучения
Исследования проводились учеными и специалистами институтов радиобиологии и биоорганической химии НАН Беларуси (г. Минск) под руководством академика Конопля Е.Ф.
Эксперименты проводили на белых крысах-самцах. Были выделены 4 группы животных по 28 особей в каждой. Животных первой группы подвергали однократному облучению в дозе 1,0 Гр, а во второй группе животные получали аналогичную дозу облучения, но многократно по 2,5 Гр в сутки. Животные 3-й (однократное облучение) и 4-й групп (многократное облучение) получали ЭМВ в дозе 100 мг/кг массы в течение 5 дней.
Как следует из графика (рис. 1), однократное облучение приводит к более выраженной лейкопении у животных, чем многократное. Однако, спустя 3 месяца после облучения, уровень лейкоцитов в крови животных, облученных однократно, восстанавливается практически до нормы, в то время как у животных, облученных многократно, лейкопения продолжает нарастать. Т.е. дробное облучение оказывает большее повреждающее действие на организм, чем однократное при равной суммарной дозе. Однако, именно дробный способ облучения применяют в комплексной программе лечения онкологических заболеваний.

Рис.1

Также изучено влияние ЭМВ на гуморальный иммунный ответ у мышей линии СВА при иммунодефиците, индуцированном однократным облучением в дозе 2 Гр.

Таблица 1

* -достоверно ниже показателя контроля, (р < 0,05),

** - достоверно выше показателя контроля, (р < 0,05).

Из таблицы 1 следует, что использование ЭМВ в дозе 50и 100 мг/кг позволяет не только поднять гуморальную составляющую иммунного статуса облученных животных до уровня интактного контроля, но и пре­высить его.
Таким образом, применение экстракта мицелия вешенки в первые 5 суток после облучения позволило снизить уровень лейкопении у животных, облученных как однократно, так и многократно, и значительно сократить время нормализации показателей крови.
ЭМВ повышает радиологическую устойчивость организма, что может служить основанием для выбора его в качестве модификатора при проведении лучевой терапии онкологических больных.
6. ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭМВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

6.1. Клиническая апробация препарата ОВО-Д у больных слимфопролиферативными заболеваниями

Исследование проведено на базе Омской государственной медицинской академии под руководством д.м.н., профессора Голевцовой З.Ш.
Целью исследования явилась оценка возможности оптимизации с помощью препарата ОВО-Д комплексной терапии хронических лимфопролиферативных заболеваний (ХППЗ), осложненных вторичным иммунодефицитом, развившимся на фоне основного заболевания и цитостатической терапии, а также его влияние на основные клинические и гематологические параметры основного заболевания, показатели иммунитета и тяжесть осложнений химиотерапии.
В исследования были включены 15 больных с ХЛПЗ в возрасте от 55 до 77 лет. У 60% больныхдиагностированалимфома, у остальных В-ХПЛ. Давность заболевания в среднем 3,5-4 года. Группа сравнения включала 19больных. Полихимиотерапия (ПХТ) основного заболевания проводилась по програм­мам СОР, ChOP, СРфлударой, курсами по 5-7 дней, с перерывами между курсами в 14-28 дней. Каждый больной основной группы и группы сравнения получил 6 курсов ПХТ.
Препарат ОВО-Д назначался больным 1 раз в сутки: во время курсов ПХТ в дозе 200 мги в течение 7-14 дней после окончания курса ПХТ в дозе 100 мг.
Терапия сопровождения в основной группе больных не назначалась, в группе сравнения все больные получали стандартную терапию сопровождения, в том числе иммуномодуляторы, антимиметики, гепато- и кардиопротекторы.
У больных, включенных в исследование, имело место сочетание нескольких типичных для данной патологии синдромов:

  1. интоксикационный (общая слабость у 86% больных, снижение аппетита у 80% больных, повышение температуры тела у 20% больных, похудение у 60% больных);
  2. гиперпластический (увеличение периферических и внутриполостных лим фоузлов и печени у 47% больных, селезенки у 93% больных);
  3. анемический (бледность, головная боль, одышка у 27% больных).

Гематологические показатели до начала лечения характеризовались лейкоцитозом, относительным и абсолютным лимфоцитозом, некоторым снижением показателей красной крови и тромбоцитов. Иммунологические нарушения выражались в уменьшении показателей CD3,CD4, CD5, CD8, CD16, CD25, CD38, CD95, увеличении экспрессии HLDR, CD23.
В процессе комплексного лечения больных основной группы изменение общего состояния характеризовалось уменьшением синдрома общей интоксикации, что проявлялось в улучшении самочувствия больных, исчезновении головной боли, слабости, потливости, нормализации сна и температуры тела.
У больных основной группы на фоне комплексного лечения (ПХТ + ОВО-Д) без использования терапии сопровождения достоверно снизилось количесво лейкоцитов (с 63 до 22), лимфоцитов (с 91 до 71 %; абс. с 31 до 17). По иммунологическим показателям отмечено достоверное уменьшение CD4 абс. (с 2,63 до 1,53), CD5 абс. (с 4,72 до 2,32), CD19 (с 7,01 до 0,91), CD20 (с 9,7до 5,28), С023(с4,32до 1,01), атакжеИРИ (с 1,41 до 0,94) на фоне достоверного увеличения CD3 (с 11 % до15%) и IgM (с 0,62 до 1,49).
Тенденция изменений в сторону нормализации в ходе лечения получена в отношении основных субпопуляций Т-лимфоцитов CD4 (с 2,63 до 1,53), CD8 (с 1,38 до 1,19), усиления естественной цитотоксичности CD16 (с 3 до 6%), апоптоза опухолевых клеток CD95 (с 0,19 до 0,44) и повышения фагоцитарной активности.
Оценка влияния препарата ОВО-Д на характер и частоту ремиссии, степень токсичности и переносимость химиотерапии, частоту и глубину лейкопении после химиотерапии больных с ХЛПЗ представлена в таблице 3.

Таблица 3

Эффект применения ПХТ

ПХТ + ОВОД(п=15)

ПХТ(п=19)

1

2

3

4

 

П/опухолевый эффект

Полная ремиссия

20,0%

10,5%

Частичная ремиссия

66,67%

52,6%

Стабилизация процесса

13,33%

26,3%

Прогрессирование процесса

0

10,5%

 

5

Степень токсичности

0-1

44,7%

31,6%

2-3

53,3%

63,2%

4

0

5,3%

6

Переносимость ПХТ по 10-бальной системе

7

2-3

7

Частота лейкопении после ХТ

13,3%

31,6%

8

Частота лейкопении после ХТ

3,5±0,4х10Лл

1,7±0,Зх10Лл


Из представленных данных видно, что у пациентов, получавших ПХТ в комплексе с ОВО-Д, чаще развивались ремиссии, не было прогрессирования болезни, меньше были клинические проявления токсичности ПХТ, лучше её переносимость, реже развивалась лейкогранулоцитопения, а её глубина (по количеству лейкоцитов) была существенно меньше, чем у пациентов, получавших ПХТ без ОВО-Д. Частоты инфекционно-воспалительных осложнений у пациентов основной группы и группы сравнения представлены в таблице 4.

Таблица4

Примечание: * - различия между группами достоверны, р <0,05.


Из приведенных данных таблицы видно, что у больных, получавших ПХТ в комплексе с ОВО-Д, частота инфекционно-воспалительных осложнений была ниже, чем в группе сопоставления, что можно расценить как доказательство иммунопротективной роли ОВО-Д у пациентов с ХЛПЗ на фоне ПХТ.
Исследуемый препарат в указанной выше суточной дозе хорошо переносился больными, за весь период наблюдения не зарегистрировано случаев осложнений, побочных эффектов и аллергических реакций, связанных с приемом препарата ОВО-Д.
Таким образом, выявлено позитивное влияние препарата ОВО-Д при совместном использовании с базовой полихимиотерапией у больных ХЛПЗ, проявляющееся в уменьшении миелотоксичности, повышении эффективности и лучшей переносимости полихимиотерапии, снижении количества инфекционно-воспалительных осложнений.

6.2.   Клиническая апробация препарата ОВО-Д у больных раком молочной железы 2-ЗА стадии
Исследования проведены в НИИ онкологии и медицинской радиологии МЗ Беларуси под руководством академика Путырского Л.А.
В исследование были включены 30 женщин в возрасте около 50 лет с инфильтрирующей карциномой молочной железы. Всем пациентам были про­ведены 3 курса полихимиотерапии по схеме ANVB (доксорубицин, навельбин) через каждые 21-28 дней. С первого дня ПХТ и далее в течение 20 дней пациенты получали препарат ОВО-Д в дозах: 1-й курс ПХТ по 300 мг в день, 2-й курс по 150 мг/день, 3-й курс по 50 мг в день.
В таблице 5 представлены результаты по частоте токсических реакций после 1 -го курса ПХТ у больных контрольной группы и у больных, принимавших препарат ОВО-Д в ходе комплексного лечения.


Таблица 5

Результаты проведенного исследования:

  1. Больные, получавшие препарат ОВО-Д, субъективно легче переносили курсы ПХТ, ощущая меньшую слабость, потливость, потерю аппетита, их жизненный тонус оставался выше.
  2. Прием препарата ОВО-Д снижал частоту алопеции почти в 2 раза.

4. Препарат хорошо переносился больными и не вызывал никаких побочных реакций.
Кроме того, в ходе исследования проводили комплексное определение клеточного, фагоцитарного и гуморального звеньев иммунного статуса по показателям крови больных. Установлено, что прием препарата ОВО-Д в ходе ПХТ приводил к нормализации иммунорегуляторных реакций, активации эффекторных звеньев иммунной системы, направленных на ликвидацию опухолевого процесса, заметному улучшению процесса элиминации продуктов распада опухолевых клеток.
Суммируя полученные данные, можно выделить наиболее характерную положительную динамику со стороны иммунной системы в ходе ПХТ с вклю­чением в схему лечения препарата ОВО-Д:

  1. Ко 2-му курсу ПХТ отмечался значительный рост количества В-лимфоци-тов и заметное увеличение Т-супрессоров, а также происходила нормали зация процессов иммунорегуляции.
  2. Усиливался биосинтез иммуноглобулинов классов A, G, М с гиперпродук цией IgG и IgM к 3-му курсу ПХТ.
  3. Концентрация ЦИК с патогенными свойствами, которая заметно увеличи валась после очередного курса ПХТ, к началу следующего курса достигала нормальных значений. Это свидетельствовало об усилении элиминации продуктов распада опухолевых клеток.
  4. Функциональная активность нейтрофилов (в частности, поглотительная функция) оставалась достаточно высокой в ходе лечения, а к 3-му курсу ПХТ отмечался её рост.
  5. Исходная интенсивность кислородозависимого метаболизма нейтрофи лов достоверно снижалась ко 2-му курсу ПХТ и оставалась на нижних границах нормы в ходе лечения.

Таким образом, применение препарата ОВО-Д в качестве средства сопровождения при полихимиотерапии больных раком молочной железы выявило его выраженное иммунопротекторное и детоксицирующее действие.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999, Sep; 221(4): 281-93.
  2. Wasser SP. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, Nov; 60(3): 58-74.
  3. Zaidman BZ, Yassin M, Mahajna J, Wasser SP. Medicinal mushroom modulators of molecular targets as cancer therapeutics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, Jun; 67(4): 453-68.
  4. Xie JT, Wang CZ, Wicks S, Yin JJ, Kong J, Li J, Li YC, Yuan CS. Ganoderma lucidum extract inhibits proliferation of SW 480 human colorectal cancer cells. Exp. Oncol. 2006, Mar; 28(1): 25-9.
  5. Нага M, Hanaoka T, Kobayashi M, Otani T, Adachi HY, Montani A, Natsukawa S, ShauraK, KoizumiY, KasugaY, MatsuzawaT, IkekawaT, Sasaki S, TsuganeS. Cruciferous vegetables, mushrooms, and gastrointestinal cancer risks in a multicenter, hospital-based case-control study in Japan. Nutr. Cancer, 2003; 46(2): 138-47.
  6. Monro JA.Treatment of cancer with mushroom products. Arch Environ Health. 2003Aug;58(8):533-7.
  7. Fullerton SA, Samadi AA, Tortorelis DG, Choudhury MS, Mallouh C, Tazaki H, Konno S. Induction of apoptosis in human prostatic cancer cells with beta-glucan (Maitake mushroom polysaccharide). MolUrol. 2000. Spring; 4(1): 7-13.
  8. Collins L, Zhu T, Guo J, Xiao ZJ, Chen CY. Phellinus linteus sensitises apoptosis induced by doxorubicin in prostate cancer. Br J Cancer. 2006. Aug. 7; 95(3): 282-8. Epub. 2006 Jul. 25.
  9. Hui KP, Sit WH, Wan JM Induction of S phase cell arrest and caspase activation by polysaccharide peptide isolated from Coriolus versicolor enhanced the cell cycle dependent activity and apoptotic cell death of doxorubicin and etoposide, but not cytarabine in HL-60 cells. Oncol. Rep. 2005. Jul;14(1): 145-55.
  10. Ye M, Liu JK, Lu ZX, Zhao Y, Liu SF, Li LL, Tan M, Weng XX, Li W, Cao Y. Grifolin, a potential antitumor natural product from the mushroom Albatrellus confluens, inhibits tumor cell growth by inducing apoptosis in vitro. FEBS Lett. 2005. Jun. 20; 579 (16): 3437-43.
  11. Kobayashi H, Yoshida R, Kanada Y, Fukuda Y, Yagyu T, Inagaki K, Kondo T, Kurita N, Suzuki M, Kanayama N, Terao T. Suppressing effects of daily oral supplementation of beta-glucan extracted from Agaricus blazei Murill on spontaneous and peritoneal disseminated metastasis in mouse model. J
    Cancer Res. Clin. Oncol. 2005 Aug;131(8):527-38. Epub 2005 May 10.
  12. Ho JC, Konerding MA, Gaumann A, Groth M, Liu WK. Fungal polysaccharopeptide inhibits tumor angiogenesis and tumor growth in mice. Life Sci. 2004, Jul. 30; 75(11): 1343-56.
  13. Inoue A, Kodama N, Nanba H. Effect of maitake (Grifola frondosa) D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion. Biol Pharm Bull. 2002, Apr;25(4):536-40.
  14. HaradaT, MasudaS, Arii M, AdachiY, NakajimaM, YadomaeT, Ohno N. Soy isoflavone aglycone modulates a hematopoietic response in combination with soluble beta-glucan: SCG. Biol. Pharm. Bull. 2005, Dec;28(12):2342-5.
  15. Ooi VE,  Liu  F. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Curr. Med. Chem. 2000 Jul;7(7):715-29.
  16. Kodama N, Komuta K, Nanba H. Can maitake MD-fraction aid cancer patients? Altern. Med. Rev. 2002 Jun;7(3):236-49.
  17. Kidd PM. The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment. Altern. Med. Rev. 2000, Feb; 5(1): 4-27.
  18. Yuen JW, Gohel MD. Anticancer effects of Ganoderma lucidum: a review of scientific evidence. Nutr. Cancer. 2005; 53(1): 11-7.
  19. Gu YH, Sivam G. Cytotoxic effect of oyster mushroom Pleurotus ostreatus on human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells. J Med Food. 2006 Summer;9(2):196-204.
  20. Kurashige S, Akuzawa Y, Endo F. Effects of Lentinus edodes, Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus administration on cancer outbreak, and ctivitiesofmacrophagesandlymphocytesinmicetreatedwithacarcinogen, N-butyl-N-butanolnitrosoamine. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1997, May; 19(2): 175-83.
  21. Bobek P, Galbavy S, Ozdin L. Effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) on pathological changes in dimethylhydrazine-induced rat colon cancer. Oncol. Rep. 1998, May-Jun; 5(3): 727-30.
  22. Zusman I, Reifen R, Livni O, Smirnoff P, Gurevich P, Sandler B, Nyska A, Gal R, Tendler Y, Madar Z. Role of apoptosis, proliferating cell nuclear antigen and p53 protein in chemically induced colon cancer in rats fed corncob fiber treated with the fungus Pleurotus ostreatus. Anticancer Res. 1997, May-un;17(3C): 2105-13.
  23. Lavi I, Friesem D, Geresh S, Hadar Y, Schwartz B. An aqueous polysaccharide extract from the edible mushroom Pleurotus ostreatus induces anti-proliferative and pro-apoptotic effects on HT-29 colon cancer cells. Cancer Lett. 2006, Nov. 28; 244(1): 61 -70.
  24. Sarangi I, Ghosh D, Bhutia SK, Mallick SK, Maiti TK. Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived Proteoglycans. Int. Immunopharmacol. 2006, Aug; 6(8): 1287-97.
  25. Wang H, Gao J, Ng TB. A new lectin with highly potent antihepatoma and antisarcoma activities from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus. Biochem Biophys Res Commun. 2000, Sep 7; 275(3): 810-6.
  26. Shlyakhovenko V, Kosak V, Olishevsky S. Application of DNA from mushroom Pleurotus ostreatus for cancer biotherapy: a pilot Study. Exp Oncol. 2006, Jun; 28(2): 132-5.
  27. Hu SH, Liang ZC, Chia YC, Lien JL, Chen KS, Lee MY, Wang YC Antihyperlipidemic and antioxidant effects of extracts from Pleurotus citrinopileatus. J Agric Food Chem 2005, 54(6) 2103-10
  28. Kimura Y. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation of the antitumor and antimetastatic actions of various compounds isolated from medicinal plants. In Vivo. 2005, 19(1)37-60.
  29. Shubert SY, Lansky EP, Neeman I. Antioxidant and eicosanoid enzyme inhibition propertiesof pomegranate seedoil and fermented juice flavonoids. J Ethnopharmacol. 1999,66(1)11-7.
  30. Lansky EP, Shubert SY, Neeman I. Pharmacological and therapeu ti c propertiesof pomegranate in Giheam-Opti on s. Mediterreneannes, 2005, 231 - 325.
  31. Afaq F, Saleem M, Krueger CG, Reed JD, Mukhtar H. Anthocyanin-and hydrolysable tannin-rich pomegranate fruit extract modulates MAPK And NF-kappaB pathways and inhibits skin tumorigenesis in CD-1 mice. Int J Cancer, 2005. 113(3)423-33.
  32. Hu H, Ahn NS, Yang X, Lee YS, Kang KS. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. Int J Cancer. 2002, 102(3) 250-3.